VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Механизмы действия физико-химических факторов на биологические системы

Определение длительностей криосохранения срезов мозга при использовании замораживающего раствора на основе агара

А.А. Мокрушин1*

1.Институт физиологии им И.П. Павлова РАН;

* mok(at)inbox.ru

В регенеративной медицине, трансплантации органов и разработке лекарств используются протективные эффекты влияния низкой температуры на биологические объекты и их криосохранение (КС). В клинике для восстановления больших участков ткани мозга реципиента требуется применение интегрированной нервной ткани соответствующих структур мозга. Именно эти эксплантаты мозга необходимы для трансплантации при таких невропатологиях, как инсульт, эпилепсия и травма. Очевидно, переживающие срезы головного мозга являются оптимальными экспериментальными объектами для разработки протоколов КС и создании криобанка нервной ткани.

Длительность КС нейронных и синаптических механизмов в нервной ткани, при которых сохраняются значения активности, равные величинам до КС является важным критерием для криобанка. Цель настоящих исследований – определить длительность сохранения активностей глутаматергических ионотропных АМПА– и НМДА–зависимых механизмов при длительном (1–3 года) КС срезов мозга негибернирующих животных – крысы линии Вистар.

В работе были исследованы протективные эффекты КС срезов обонятельной коры в специально разработанном замораживающем растворе, состоящем из искусственного цереброспинального раствора (ИЦР) (мМ: 124.0 NaCl; 5.0 KCl; 2.6 CaCl2; 1.24 KH2PO4; 1.2 MgSO4; 3.0 NaHCO3; 10.0 глюкозы; рН 7.3) и агара. Замораживающий раствор для криосохранения срезов готовили в следующей последовательности. Агар Difco Bactor (США) (3 г) заливали 100 мл 1 М NaCl и выдерживали 10 дней в термостате при +32 – +35°С. Полученный гелевый раствор центрифугировали при скорости 2000 об/мин в течение 10 мин. Легкую фракцию отсасывали из раствора и использовали для приготовления среды для криосохранения срезов: – 1.0 мл легкой фракции агара и 1.0 мл ИЦР (конечная концентрация агара 50%). Срезы головного мозга помещали в стеклянные флаконы с этой средой. Затем флаконы со срезами постепенно замораживали до –10 °С при медленной скорости (0.1°С/мин) в морозильной камере с термостатом и хранили в течение: 52 сут, 1год, 2 года, 3 года. Спустя указанные интервалы времени флаконы со срезами отогревали до +37°С с медленной скоростью 0.1°С/мин извлекали срезы, помещали их в перфузионную камеру электрофизиологической установки и регистрировали амплитуды АМПА- и НМДА-потенциалов. Полученные значения соотносили к величинам до КС и выражали в процентах.

Проведенные исследования по криосохранению активности АМПА и НМДА механизмов в замораживающем растворе показали, что оптимальной концентрацией агара в гелевом растворе была 50%. Сохранение активности АМПА и НМДА механизмов составляло 87 и 99 %, соответственно, к значениям до КС. Затем, используя этот гелевый раствор (50% + ИЦР) были исследованы сохранения амплитуд АМПА и НМДА потенциалов в различные интервалы времени после начала КС.

Было обнаружено, что АМПА и НМДА механизмы проявляют различную криостабильность к длительности КС. АМПА механизмы были наиболее устойчивы и сохраняли свою активность в течение 3 лет (в среднем 97 % по сравнению к значениям до КС). НМДА оказались менее устойчивы, и их активность сохранялась в течение 1 года (в среднем 95 % по отношению к значениям до КС).

Снижение активности АМПА и НМДА механизмов при длительном КС срезов мозга после обнаруженных временных интервалов свидетельствуют о том, что агаровый гелевый раствор подвергается старению – процесс синерезиса. Это связано с нарушением структуры агарового геля и потерей воды из самого геля и, соответственно, из срезов мозга.

Для укрепления структуры геля и пролонгации временных интервалов КС срезов мозга были испытаны различные вещества эндогенного происхождения: мистиксин (синтетический КРФ подобный пептид), белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, дипептид L-карнозин. Наиболее эффективным оказался дипептид L-карнозин.

Добавление L-карнозина (20 мМ) в раствор со срезом и последующая процедура замораживания-оттаивания приводила к пролонгации времени КС НМДА механизмов до 3 лет, АМПА- более 4 лет.

Разработанный и исследованный протокол КС эксплантатов головного мозга (срезов) теплокровных в замораживающем растворе ИЦР с агаром будет использован для создания криобанка, для длительного хранения эксплантов нервной ткани.

Determination of durations of cryopreservation of brain slices using an agar-based freezing solution

А.А. Mokrushin 1*

1.Pavlov Institute Physiology RAS;

* mok(at)inbox.ru



In regenerative medicine, organ transplantation, and drug development, the protective effects of low temperature on biological objects and their cryopreservation (CP) are used. In the clinic, to restore large areas of the brain tissue of the recipient, the use of integrated nervous tissue of the corresponding brain structures is required. It is these brain explants that are needed for transplantation in neuropathologies such as stroke, epilepsy, and trauma. Obviously, brain slices are optimal experimental objects for the development of CP protocols and the creation of a nervous tissue cryobank.

The duration of the CP of neuronal and synaptic mechanisms in the nervous tissue, at which the activity values equal to the values before the CP are preserved, is an important criterion for a cryobank. The purpose of this study is to determine the duration of the preservation of the activities of glutamatergic ionotropic AMPA- and NMDA-dependent mechanisms during long-term (1-3 years) CP of brain slices of non-hibernating animals - Wistar rats.

We studied the protective effects of CP of olfactory cortex slices in a specially designed freezing solution consisting of artificial cerebrospinal solution (ACS) (mM: 124.0 NaCl; 5.0 KCl; 2.6 CaCl2; 1.24 KH2PO4; 1.2 MgSO4; 3.0 NaHCO3; 10.0 glucose; pH 7.3 ) and agar. Freezing solution for cryopreservation of slices was prepared in the following sequence. Difco Bactor agar (USA) (3 g) was filled with 100 ml of 1 M NaCl and incubated for 10 days in a thermostat at +32–+35°C. The resulting gel solution was centrifuged at 2000 rpm for 10 min. The light fraction was aspirated from the solution and used to prepare the medium for cryopreservation of slices: – 1.0 ml of the light fraction of agar and 1.0 ml of ACS (final agar concentration 50%). The brain slices were placed in glass vials with this medium. Then, the vials with slices were gradually frozen to –10°С at a slow speed (0.1°С/min) in a freezer with a thermostat and stored for: 52 days, 1 year, 2 years, 3 years. After the specified time intervals, the vials with slices were warmed to +37°C at a slow rate of 0.1°C/min. The slices were removed, placed in the perfusion chamber of the electrophysiological unit, and the amplitudes of AMPA and NMDA potentials were recorded. The obtained values were expressed as percentages relative to the values before CP.

Studies on cryopreservation of the activity of AMPA and NMDA mechanisms in the freezing solution showed that the optimal concentration of agar in the gel solution was 50%. Preservation of activity of AMPA and NMDA mechanisms was 87 and 99%, respectively, to the values before CP. Then, using this gel solution (50% + ACS), the preservation of amplitudes of AMPA and NMDA potentials at various time intervals after the start of CP was investigated.

It was found that AMPA and NMDA mechanisms exhibit different cryostability to CP duration. AMPA mechanisms were the most stable and retained their activity for 3 years (average 97% compared to pre-CP). NMDA turned out to be less stable, and their activity persisted for 1 year (average 95% in relation to the values before CP).

A decrease in the activity of AMPA and NMDA mechanisms during prolonged CP of brain slices after the detected time intervals indicates that the agar gel solution undergoes aging - the process of syneresis. This is due to a violation of the structure of the agar gel and the loss of water from the gel itself and, accordingly, from brain slices.

To strengthen the gel structure and prolong the CP time intervals of brain slices, various substances of endogenous origin were tested: mystixin (synthetic CRF-like peptide), heat shock protein with a molecular weight of 70 kDa, and dipeptide L-carnosine. The most effective was the dipeptide L-carnosine.

The addition of L-carnosine (20 mM) to freezing solution and the subsequent freeze-thaw procedure led to the prolongation of the CP time of NMDA mechanisms up to 3 years, AMPA - more than 4 years.

The developed and studied protocol for CP of brain explants (slices) of warm-blooded animals in a freezing solution with agar will be used to create a cryobank for long-term storage of nervous tissue explants.



Докладчик: Мокрушин А.А.
417
2022-12-28

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists