Дипептид L-карнозин (β-аланил-L-гистидин), эндогенный дипептид, синтезируемый ферментом карнозинсинтаза 1 (CARNS1) из аминокислот, β-аланина (синтезируется в печени) и L-гистидина (получаемый из пищи). Содержание этого дипептида наиболее высокие (миллимолярный порядок концентраций) в сердечных и скелетных мышцах, а также в головном мозге млекопитающих особенно в обонятельной луковице и обонятельной коре (1–2 мМ).

Обнаружено что L-карнозин вызывает плейотропные позитивные эффекты в организме. L-карнозин проявляет свойства антиоксиданта, нейтрализует активные формы кислорода, а также предотвращает перекисное окисление липидов, сохраняя структуру клеточных мембран. Дипептид препятствует процессу гликелирования, т.е. окисления белков глюкозой и связывает образующиеся при гликолизе протоны. Он выполняет роль внутриклеточного pH-буфера.

Продемонстрирован протективный потенциал L-карнозина. В условиях развития ишемического и геморрагического поражений мозговых структур дипептид проявил себя эффективным протектором нервных клеток. Положительные эффекты карнозина наблюдались при лечении нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.).

Основываясь на представленных данных, что L-карнозин является мультипотентным протектором в структурах нервной системы, мы исследовали его криопротекторные свойства в процессе длительного криосохранения (КС). Для того чтобы проверить эту гипотезу, были изучены эффекты аппликации L-карнозина на экспериментальной модели – переживающие срезы обонятельной коры мозга крыс. Анализировали изменения активности NMDAR при регистрации NMDA-потенциалов, вызываемых электрической стимуляцией латерального обонятельного тракта. NMDAR являются наиболее уязвимыми механизмами при действие долговременного КС.

Протокол КС срезов с L-карнозином проводился в следующей последовательности. Срезы в течение 20 мин перфузировали искусственной цереброспинальным раствором (ИЦР) (мМ: 124.0 NaCl; 5.0 KCl; 2.6 CaCl2; 1.24 KH2PO4; 1.2 MgSO4; 3.0 NaHCO3; 10.0 глюкозы; рН 7.3) в проточной камере электрофизиологической установки и регистрировали амплитуды NMDA-потенциалов (мкВ). Полученные значения амплитуд NMDA-потенциалов рассматривали как контрольные перед замораживанием и принимали за 100%. Затем срезы перфузировали ИЦР с добавлением L-карнозина в концентрации 20 мМ в течение 20 мин и регистрировали NMDA-потенциалы. Далее срезы замораживали в растворе ИЦР с L-карнозином при медленной скорости (0.1°С/мин) до –10°С и хранили в морозильнике термостата. Через 30 сут КС срезы отогревали до 37°С с такой же скоростью (0.1°С/мин), при этом солевой состав среды и концентрация L-карнозина не менялись. Вновь регистрировали NMDA-потенциалы и выражали в % по отношению к значениям до КС.

В отдельной серии опытов изучали изменения рН ИЦР со срезом мозга до и после КС с L-карнозином с помощью pH-метра. В специальной серии опытов изучали влияние L-карнозина на гидратацию/дегидратацию срезов мозга, используя измерения их веса до и после КС.

Результаты проведенных исследований показали, что дипептид L-карнозин оптимизировал рН раствора до рН 7.4 после КС (–10°С, 30 сут) и сохранял активность NMDAR, определяемых по амплитуде NMDA-потенциалов. Отметим, что без использования L-карнозина рН среды со срезами после КС сильно закислялся до рН 6.5 вместо нормальных значений рН 7.2-7.7. В этих условиях активность NMDAR необратимо блокировалась. Эти данные свидетельствуют, что L-карнозин является «ловушкой» протонов и таким образом действует как криопротектор.

Процесс дегидратации/гидратации нервных клеток и межклеточного пространства имеет существенное значение в сохранении жизнеспособности структур нервной ткани в процессе КС. L-карнозин после КС вызывал уменьшение свободной воды в срезах. Такой эффект дипептида способствовал сохранению активности NMDAR после КС равной до КС. Полагаем, что L-карнозин способствует переходу свободной воды из нервных клеток в межклеточное пространство и таким образом становится нуклеатором льда, предохраняя клетки от разрушения в процессе замораживания/КС/отогревания. Следовательно, экзогенный L-карнозин проявляет свойства криопротектора.

Регистрация активности NMDAR, определяемых по амплитуде НМДА-потенциалов, в процессе отогревания после КС показала, что L-карнозин двукратно снижал уровень гипервозбудимости этих рецепторов. Этот факт указывает, что дипептид ингибирует развитие глутаматной эксайтотоксичности, развивающейся при отогревании срезов после КС и способствует сохранению нормального функционирования NMDA механизмов как наиболее уязвимых механизмов к замораживанию/отогреванию.

Таким образом, полученные результаты доказывают, что дипептид L-карнозин проявляет свойства эндогенного (нетоксичного) криопротектора в эксплантах мозга теплокровных негибернирующих животных.

Dipeptide L-carnosine (β-alanyl-L-histidine), an endogenous dipeptide synthesized by the enzyme carnosine synthase 1 (CARNS1) from the amino acids β-alanine (synthesized in the liver) and L-histidine (obtained from food). The content of this dipeptide is highest (millimolar order of concentration) in cardiac and skeletal muscles, as well as in the brain of mammals, especially in the olfactory bulb and olfactory cortex (1–2 mM).

L-carnosine has been found to cause pleiotropic positive effects in organisms. The dipeptide exhibits antioxidant properties, neutralizes reactive oxygen species, and also prevents lipid peroxidation, while maintaining the structure of cell membranes. L-carnosine prevents the glycation process, i.e. oxidation of proteins by glucose and binds the protons formed during glycolysis. It acts as an intracellular pH buffer.

The protective potential of L-carnosine has been demonstrated. Under conditions of development of ischemic and hemorrhagic lesions of brain structures, the dipeptide proved to be an effective protector of nerve cells. The positive effects of carnosine have been observed in the treatment of neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's, etc.).

Based on the presented data that L-carnosine is a multipotent protector in the structures of the nervous system, we studied its cryoprotective properties during long-term cryopreservation (CP). In order to test this hypothesis, the effects of L-carnosine application were studied in an experimental model –slices of the olfactory cortex of the rat brain. Changes in NMDAR activity were analyzed upon registration of NMDA potentials induced by electrical stimulation of the lateral olfactory tract. NMDARs are the most vulnerable mechanisms under long-term CP.

The protocol of CP slices with L-carnosine was carried out in the following sequence. Slices were perfused for 20 min with artificial cerebrospinal solution (ACS) (mM: 124.0 NaCl; 5.0 KCl; 2.6 CaCl2; 1.24 KH2PO4; 1.2 MgSO4; 3.0 NaHCO3; 10.0 glucose; pH 7.3) in the flow chamber of the electrophysiological setup and recorded the amplitudes of NMDA potentials (µV). The obtained values of the amplitudes of the NMDA potentials were considered as control before freezing and were taken as 100%. Then the slices were perfused with ACS with the addition of L-carnosine at a concentration of 20 mM for 20 min, and NMDA potentials were recorded. Further the slices were frozen in an ACS solution with L-carnosine at slow speed (0.1°C/min) down to –10°C and stored in a thermostat freezer. After 30 days of CP, the slices were warmed to 37°C at the same rate (0.1°C/min), while the salt composition of the medium and the concentration of L-carnosine did not change. The NMDA potentials were registered in slices and expressed in % relative to the values before CP.

In a separate series of experiments, were studied changes in the pH of the ACS with a brain slice before and after CP with L-carnosine using a pH meter. In a special series of experiments, the effect of carnosine on the hydration/dehydration of brain slices was studied using measurements of their weight before and after CS.

The results of the studies showed that the dipeptide L-carnosine optimized the pH of the solution to pH 7.4 after CP (–10°C, 30 days) and retained the activity of NMDAR, determined by the amplitude of NMDA potentials. Note that without the use of L-carnosine, the pH of the solution with slices after CP was strongly acidified to pH 6.5 instead of the normal pH values of 7.2–7.7. Under these conditions, NMDAR activity was irreversibly blocked. These data indicate that L-carnosine is a proton trap and thus acts as a cryoprotectant.

The process of dehydration/hydration of nerve cells and intercellular space is essential in maintaining the viability of the structures of the nervous tissue during CP. L-carnosine after CP caused a decrease of the free water in slices. This effect of the dipeptide contributed to the preservation of NMDAR activity after CP equal to that before CP. We believe that L-carnosine promotes the transfer of free water from nerve cells to the intercellular space and thus becomes an ice nucleator, protecting cells from destruction during freezing/CP/warming. Therefore, exogenous L-carnosine exhibits cryoprotective properties.

Registration of NMDAR activity, determined by the amplitude of NMDA potentials, during rewarming after CP showed that L-carnosine reduced twice the level of hyperexcitability of these receptors. This fact indicates that the dipeptide inhibits the development of glutamate excitotoxicity, which develops when slices are rewarmed after CP, and contributes to the preservation of the normal functioning of NMDA mechanisms as the most vulnerable mechanisms to freezing/thawing.

Thus, the obtained results prove that the dipeptide L-carnosine exhibits the properties of an endogenous (non-toxic) cryoprotectant in brain explants of warm-blooded non-hibernating animals.