Побочные эффекты со стороны нормальных тканей, возникающие в процессе лучевой терапии по поводу злокачественных новообразований, до сих пор представляют собой одну из нерешенных проблем современной радиационной онкологии. Фотобиомодуляция (ФБМ) на основании положительных результатов клинической практики в течение многих лет используется для профилактики и лечения побочных эффектов облучения, однако ее воздействие может происходить непосредственно в зоне расположения опухолевого очага (например, при опухолях полости рта и глотки). С этой точки зрения, необходима оценка возможного стимулирующего и адаптивного эффекта фотобиомодуляции в отношении опухолевых клеток, которые могут оказаться в зоне светового воздействия параллельно с проведением лучевой терапии, а также изучение механизмов сочетанного действия ионизирующего и низкоинтенсивного оптического излучения на опухолевые клетки.

Целью данной работы было изучение влияния фотобиомодуляции видимого красного диапазона в сочетании с ионизирующим излучением на жизнеспособность, митохондриальный потенциал и клеточный цикл клеточной линии Hela Kyoto, в зависимости от дозы ионизирующего излучения, флюенса ФБМ, а также последовательности этих воздействий.

На первом этапе эксперимента на клетки опухоли воздействовали фотобиомодуляцией с флюенсами 3 мДж/см2, 30 мДж/см2 и 300 мДж/см2, а также 0,5 Дж/см2, 1 Дж/см2 и 2 Дж/см2, через час клетки облучались гамма-излучением в дозах 2 Гр, 4 Гр и 6 Гр. Через сутки после облучения производилась оценка жизнеспособности клеток методом МТТ-теста. На втором этапе первично проводилось гамма-облучение опухолевых клеток Hela в дозах 2 Гр, 4 Гр и 6 Гр, после чего на клетки воздействовали ФБМ с флюенсами, указанными выше. Через сутки проводилась оценка жизнеспособности клеток методом МТТ-теста. В качестве контроля использовались клетки после гамма-облучения в соответствующих дозах. Изучалось влияние различных режимов ФБМ в сочетании с ИИ на клеточный цикл и митохондриальный потенциал опухолевых клеток после сочетанного воздействия в режимах, описанных выше. Эксперименты проводились на проточном цитофлуориметре FacsAriaIII (Becton, Dickinson and Company, США). Определение фаз клеточного цикла для клеток проводили при помощи набора для определения фаз клеточного цикла (APC BrdU Flow Kit, кат. № 552598 Becton, Dickinson and Company, США) с бромдезоксиуридином, меченным АРС. Метод основан на совместном окрашивании общей ДНК 7-аминоактиномицином (7-AAD) и бромдезоксиуридином (BrdU). BrdU включается во вновь синтезированную клетками ДНК, входящими и проходящими через S-фазу клеточного цикла (синтез ДНК). При комбинации 7-AAD и инкорпорированного BrdU двухцветный проточный цитометрический анализ позволяет перечислять и характеризовать клетки, которые активно синтезируют ДНК с точки зрения их положения в клеточном цикле. По интенсивности окраски 7-Aminoactinomycin D судили о распределении клеток по фазам клеточного цикла и судили о процентном разделении клеток находящимся в S-фазе, фазе G0/G1 и перешедшим в фазу G2/M.

Для определения трансмембранного потенциала митохондрий клеток использовали краситель MitoStatus TMRE (BD Pharmingen, США) - этиловый эфир тетраметилродамина, катионный липофильный флуоресцентный краситель, и 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) (BD Pharmingen, США) - ДНК-связывающийся флуоресцентный краситель. Гейтирование проводили по присутствию в клетках красителей: 1) живые клетки с деполяризованной митохондриальной мембраной: TMRE(-) и 7-AAD(-); 2) живые клетки с неповрежденной митохондриальной мембраной: TMRE(+) и 7-AAD(-); 3) мертвые клетки с деполяризованной митохондриальной мембраной: TMRE(+) и 7-AAD(+); 4) мертвые клетки с неповрежденной митохондриальной мембраной: TMRE(-) и 7-AAD(+). При проведении подсчетов учитывали количество живых клеток с неповрежденной ММ, количество мертвых клеток с неповрежденной ММ и общее количество клеток (живых и мертвых) с деполяризованной ММ.

В результате исследования было выяснено, что фотобиомодуляция приводит к разнонаправленным эффектам в зависимости от дозы ионизирующего излучения, флюенса и последовательности этих воздействий на клетки. Предварительное воздействие фотобиомодуляции вызвало незначительное, но статистически значимое ингибирование пролиферации опухолевых клеток. В тоже время у опухолевых клеток, предварительно подвергнутых воздействию ионизирующего излучения (стимулирующий эффект), ФБМ с низкими флюенсами вызвало повышение пролиферативной активности. А воздействие фотобиомодуляции с высокими флюенсами, напротив, в некоторых случаях вызвало статистически значимое ингибирование клеточной пролиферации. При изучении изменения потенциала на внутренней ММ было показано, что возрастание количества живых клеток после ФБМ происходит именно за счет снижения доли клеток с деполяризованной митохондриальной мембраной, что соответствуют данным МТТ-теста, который продемонстрировал повышение количества жизнеспособных опухолевых клеток при проведении ФБМ после гамма-облучения. Анализ клеточного цикла опухолевых клеток при различных режимах облучения показал, что воздействие ИИ вызывает блок митоза клеток и их накопление в фазе G0/G1, в свою очередь дополнительное воздействие фотобиомодуляции в некоторых случаях может усиливать этот процесс и увеличивать процент клеток накопившихся в данной фазе.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (грант №20-02-00531).

Side effects from normal tissues that occur during radiation therapy for malignant neoplasms still represent one of the unsolved problems of modern radiation oncology. Photobiomodulation (PBM) based on the positive results of clinical practice has been used for many years for the prevention and treatment of side effects of radiation, but its effects can occur directly in the area of the location of the tumor focus (for example, with tumors of the oral cavity and pharynx). From this point of view, it is necessary to assess the possible stimulating and adaptive effect of photobiomodulation on tumor cells that may be exposed to light in parallel with radiation therapy, as well as to study the mechanisms of the combined effect of ionizing and low-intensity optical radiation on tumor cells.

The aim of this work was to study the effect of photobiomodulation of the visible red range in combination with ionizing radiation on the viability, mitochondrial potential and cell cycle of the Hela Kyoto cell line, depending on the dose of ionizing radiation, PBM fluence, as well as the sequence of these effects.

At the first stage of the experiment, tumor cells were exposed to photobiomodulation with fluences of 3 mJ/cm2, 30 mJ/cm2 and 300 mJ/cm2, as well as 0.5 J/cm2, 1 J/cm2 and 2 J/cm2, after an hour the cells were irradiated with gamma radiation at doses of 2 Gy, 4 Gy and 6 Gy. A day after irradiation, cell viability was assessed by the MTT test. At the second stage, gamma irradiation of Hela tumor cells was initially carried out at doses of 2 Gy, 4 Gy and 6 Gy, after which the cells were exposed to PBM with fluences indicated above. A day later, the viability of the cells was assessed by the MTT test. Cells after gamma irradiation in appropriate doses were used as a control. The effect of various modes of PBM in combination with AI on the cell cycle and mitochondrial potential of tumor cells after combined exposure in the modes described above was studied. The experiments were carried out on a flow cytofluorimeter FacsAriaIII (Becton, Dickinson and Company, USA). Determination of cell cycle phases for cells was carried out using a cell cycle phase detection kit (APC BrdU Flow Kit, cat. No. 552598 Becton, Dickinson and Company, USA) with bromodeoxyuridine labeled with ARS. The method is based on the joint staining of common DNA with 7-aminoactinomycin (7-AAD) and bromodeoxyuridine (BrdU). BrdU is incorporated into newly synthesized DNA by cells entering and passing through the S-phase of the cell cycle (DNA synthesis). With a combination of 7-AAD and incorporated BrdU, two-color flow cytometric analysis allows you to list and characterize cells that actively synthesize DNA in terms of their position in the cell cycle. By the intensity of 7-Aminoactinomycin D staining, the distribution of cells by phases of the cell cycle was judged and the percentage of cell separation was judged for those in the S-phase, G0/G1 phase and those in the G2/M phase.

To determine the transmembrane potential of the mitochondria of cells, the dye MitoStatus TMRE (BD Pharmingen, USA) - tetramethylrodamine ethyl ether, cationic lipophilic fluorescent dye, and 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) (BD Pharmingen, USA) - DNA-binding fluorescent dye were used. Gating was carried out by the presence of dyes in the cells: 1) living cells with depolarized mitochondrial membrane: TMRE(-) and 7-AAD(-); 2) living cells with intact mitochondrial membrane: TMRE(+) and 7-AAD(-); 3) dead cells with depolarized mitochondrial membrane: TMRE(+) and 7-AAD(+); 4) dead cells with intact mitochondrial membrane: TMRE(-) and 7-AAD(+). During the calculations, the number of living cells with intact MM, the number of dead cells with intact MM and the total number of cells (living and dead) with depolarized MM were taken into account.

As a result of the study, it was found out that photobiomodulation leads to multidirectional effects depending on the dose of ionizing radiation, fluence and the sequence of these effects on cells. Preliminary exposure to photobiomodulation caused a slight but statistically significant inhibition of tumor cell proliferation. At the same time, in tumor cells previously exposed to ionizing radiation (stimulating effect), PBM with low fluences caused an increase in proliferative activity. And the effect of photobiomodulation with high fluences, on the contrary, in some cases caused a statistically significant inhibition of cell proliferation. When studying the potential change on the inner MM, it was shown that the increase in the number of living cells after PBM occurs precisely due to a decrease in the proportion of cells with a depolarized mitochondrial membrane, which corresponds to the data of the MTT test, which demonstrated an increase in the number of viable tumor cells during PBM after gamma irradiation. Analysis of the cell cycle of tumor cells under various irradiation modes showed that the effect of AI causes a block of cell mitosis and their accumulation in the G0/G1 phase, in turn, additional exposure to photobiomodulation in some cases can enhance this process and increase the percentage of cells accumulated in this phase.

The study was carried out with the financial support of the RFBR (grant No. 20-02-00531).