Бычий сывороточный альбумин (далее БСА) известен своими функциональными и технологическими свойствами, одним из которых является возможность связывания лигандов [1]. Ранее нами было показана возможность получения комплекса БСА с галловой кислотой для пищевой добавки с оптимальным составом [2]. Использование данного комплекса в пищевой промышленности для придания антиоксидантных свойств продуктам с функциональными свойствами предполагает проведение пастеризации и сохранение стабильности под влиянием высоких температур. Целью данной работы является изучение изменения термостабильности по показателям ИК-Фурье спектроскопии комплекса БСА с галловой кислотой.

Для проведения исследования использован комплекс, полученный в соответствии с ранее описанным методом [2]. Моделировали термическую обработку молочных продуктов (процесс пастеризации) в трех температурных диапазонах с различным временем выдержки образца – 62-65°С в течение 30 минут, 72-75°С в течение 30 секунд и 85-90°С без выдержки. В комплексе БСА с галловой кислотой в жидких образцах исследовали трансформацию химических связей при помощи ИК-Фурье спектрометра Nicolet iS50 (Thermo Scientific, USA) на приставке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) Smart iTR ATR (ZnSe) (Thermo Scientific, USA).

Исследуемые ИК-спектры содержали различные уширенные пики в исследуемых диапазонах, что затрудняло процесс анализа. Для анализа использованы производные исходных спектров первого порядка с дифференцированием по методу Савицкого-Голея [3]. Термостабильность оценивалась по изменениям интенсивностей и сдвигов полос в регионе амида I, а именно 2 основные волны поглощения, отображающие происходящие изменения с БСА при температурном воздействии – 1652 см¯¹ и 1675 см¯¹ [4]. Данные длины волн характерны для изменений α-спирали БСА и разворачивания молекулы в пространстве, соответственно. Рассматривались совместно спектры БСА, прореагировавшего с полифенолом, и без него – контроль.

В контрольном образце на длине волны 1652 см¯¹ с ростом температуры выявлено постепенное снижение оптической плотности (-1,4×10³, -1,42×10³ и -1,5×10³ соответственно для 62-65°С, 72-75°С и 85-90°С), что указывает на уменьшение доли α-спиралей во вторичной структуре. На полосе поглощения 1675 см¯¹ наблюдается постепенное увеличение оптической плотности (-1,20×10³, -1,15×10³ и -1,14×10³ соответственно, с повышением температуры: 62-65°С, 72-75°С и 85-90°С), что указывает на увеличение доли случайных витков в молекуле БСА. Данные изменения свидетельствовали о денатурации исходной молекулы под действием температуры.

В экспериментальных образцах во всех исследуемых спектрах обнаруживается коротковолновый сдвиг. Так, ожидаемый пик 1652 см¯¹ наблюдается на 1653,7 см¯¹, а 1675 см¯¹ на 1676,5 см¯¹. Подобные сдвиги указывают на изменения характера пептидных связей в комплексе, что можно связать с образованием связей между БСА и полифенолом. На длине волны 1652 см¯¹ в образцах комплекса, аналогично контролю, при температурном воздействии при росте температуры (62-65°С, 72-75°С и 85-90°С) происходит снижение оптической плотности, соответственно: -1,44×10³, -1,46×10³ и -1,47×10³. На полосе поглощения 1675 см¯¹ оптическая плотность росла: 62-65°С (-1,23×10³), 72-75°С (-1,13×10³) и 85-90°С (-1,03×10³). В изучаемом комплексе БСА с галловой кислотой изменения обусловлены долей α-спиралей во вторичной структуре, что связано с образованием самого комплекса. При температурном воздействии видно, что даже при высоких диапазонах температур (85-90°С) доля α-спиралей в комплексе сохраняется в большем количестве (-1,47×10³), нежели в контроле – (-1,5×10³). На длине волны 1675 см¯¹ наблюдается более значительное увеличение доли разворота молекулы БСА в комплексе (-1,03×10³), чем в контроле (-1,14×10³).

Таким образом, галловая кислота позволяет стабилизировать молекулу БСА при температурном воздействии в диапазоне пастеризации молочных продуктов и данный комплекс может быть использован в пищевой промышленности в соответствующих условиях производства.



Исследование финансировалось из средств гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации «Изучение механизмов взаимодействия молочнокислых микроорганизмов, лактозосбраживающих дрожжей и биологически активных веществ при микроинкапсулировании различных фракций микробиоты», Соглашение № 075-15-2022-1129 от 01.07.2022 г.

1. Patil V., Labade S., Khilare Ch. et al. A molecular bridge-like binding mode of buspirone to BSA: Multispectroscopic and molecular docking investigation // Chemical Data Collcetions, 2022, № 40, 100892.

2. Fedortsov N.M., Budkevich E.V., Evdokimov I.A. et al. Bovine serum albumin with gallic acid: molecular modeling and physicochemical profiling // Foods and Raw Materials, 2022, Т. 10. № 1. pp. 163-170.

3. A.P. Fellows, M.T.L. Casford, P.B. Davies. Spectral Analysis and Deconvolution of the Amide I Band of Proteins Presenting with High-Frequency Noise and Baseline Shifts // Applied Spectroscopy, 2020, T. 74, №5, рр. 597–615.

4. Krimm S., Bandekar J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins // Adv Protein Chem, 1986. №38. рр. 181-364.

Bovine serum albumin (BSA) is known for its functional and technological properties, one of which is the ability to bind ligands [1]. Previously, we have shown the possibility of obtaining a complex of BSA with gallic acid for a food supplement with an optimal composition [2]. The use of this complex in the food industry to impart antioxidant properties to products with functional properties involves pasteurization and preservation of stability under the influence of high temperatures. The purpose of this work is to study the change in thermal stability in terms of IR-Fourier spectroscopy of the BSA complex with gallic acid.

For the study, a complex obtained in accordance with the previously described method [2] was used. The heat treatment of dairy products (pasteurization process) was simulated in three temperature ranges with different sample holding times: 62–65°C for 30 minutes, 72–75°C for 30 seconds, and 85–90°C without holding. In the complex of BSA with gallic acid in liquid samples, the transformation of chemical bonds was studied using a Nicolet iS50 IR-Fourier spectrometer (Thermo Scientific, USA) on an attenuated total internal reflection (ATR) Smart iTR ATR (ZnSe) attachment (Thermo Scientific, USA).

The studied IR spectra contained various broadened peaks in the studied ranges, which made the analysis process difficult. For the analysis, derivatives of the initial spectra of the first order with differentiation by the Savitsky-Golay method [3] were used. Thermal stability was assessed by changes in the intensities and shifts of the bands in the region of amide I, namely, 2 main absorption waves reflecting the ongoing changes with BSA under temperature exposure - 1652 cm¯¹ and 1675 cm¯¹ [4]. These wavelengths are characteristic of changes in the BSA α-helix and the unfolding of the molecule in space, respectively. The spectra of BSA reacted with polyphenol and without it (control) were considered together.

In the control sample at a wavelength of 1652 cm¯¹, with increasing temperature, a gradual decrease in optical density was observed (-1.4 × 10³, -1.42 × 10³ and -1.5 × 10³, respectively, for 62-65°C, 72-75 °C and 85-90°C), which indicates a decrease in the proportion of α-helices in the secondary structure. On the absorption band at 1675 cm¯¹, a gradual increase in optical density is observed (-1.20 × 10³, -1.15 × 10³ and -1.14 × 10³, respectively, for 62-65°C, 72-75°C and 85-90 °C), which indicates an increase in the proportion of random structures in the BSA molecule. These changes indicated the denaturation of the original molecule under the influence of temperature.

A short-wavelength shift is observed in all studied spectra of the complex. Thus, the expected peak at 1652 cm¯¹ is observed at 1653.7 cm¯¹, and 1675 cm¯¹ at 1676.5 cm¯¹. Such shifts indicate changes in the nature of peptide bonds in the complex, which can be associated with the formation of bonds between BSA and polyphenol. At a wavelength of 1652 cm¯¹ in the samples of the complex under temperature exposure, a decrease in optical density is also observed - -1.44 × 10³, -1.46 × 10³ and -1.47 × 10³, respectively, for 62-65°C, 72-75°С and 85-90°С. At the absorption band of 1675 cm¯¹, the optical density increased - -1.23×10³, -1.13×10³ and -1.03×10³, respectively, for 62-65°С, 72-75°С and 85-90°С. The studied complex initially has a greater influence on the proportion of α-helices in the secondary structure, which is associated with the formation of the complex itself. With further temperature exposure, it can be seen that even at high temperature ranges (85-90°C), the proportion of α-helices in the complex is retained in a larger amount (-1.47 × 10³) than in the control - (-1.5 × 10³). At a wavelength of 1675 cm¯¹, a more significant increase in the proportion of random structures of the BSA molecule in the complex (-1.03×10³) is observed than in the control (-1.14×10³).

Thus, gallic acid makes it possible to stabilize the BSA molecule under the influence of temperature in the range of pasteurization of dairy products, and this complex can be used in the food industry under appropriate production conditions.



The study was funded by a grant from the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation "Study of the mechanisms of interaction of lactic acid microorganisms, lactose-fermenting yeast and biologically active substances during microencapsulation of various fractions of microbiota", Agreement No. 075-15-2022-1129 of 01.07.2022

1. Patil V., Labade S., Khilare Ch. et al. A molecular bridge-like binding mode of buspirone to BSA: Multispectroscopic and molecular docking investigation // Chemical Data Collcetions, 2022, № 40, 100892.

2. Fedortsov N.M., Budkevich E.V., Evdokimov I.A. et al. Bovine serum albumin with gallic acid: molecular modeling and physicochemical profiling // Foods and Raw Materials, 2022, Т. 10. № 1. pp. 163-170.

3. A.P. Fellows, M.T.L. Casford, P.B. Davies. Spectral Analysis and Deconvolution of the Amide I Band of Proteins Presenting with High-Frequency Noise and Baseline Shifts // Applied Spectroscopy, 2020, T. 74, №5, рр. 597–615.

4. Krimm S., Bandekar J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins // Adv Protein Chem, 1986. №38. рр. 181-364.