VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Механизмы действия физико-химических факторов на биологические системы

Механизмы УФ-индуцированной клеточной гибели лимфоцитов человека

М.А. Наквасина1,2*, В.Г. Артюхов1,2, М.С. Радченко1,2

1.Воронежский государственный университет;
2.Воронежский государственный университет;

* nakvasina_ma(at)mail.ru

Одной из ключевых проблем биофизики клетки является выявление закономерностей клеточной гибели как фундаментального общебиологического явления. Изучение механизмов гибели клеток, выявление маркеров (показателей) ее типов, поиск способов их регулирования – ключ к пониманию закономерностей процессов морфо- и эмбриогенеза, поддержания клеточного гомеостаза, биологического действия физико-химических агентов, патогенеза различных заболеваний человека и разработке эффективных методов их лечения.

Исследованы механизмы и последовательность развития и реализации этапов программированной клеточной гибели лимфоцитов периферической крови доноров в условиях воздействия УФ-света (240–390 нм) в дозах 151, 1510 и 3020 Дж/м2.

Обнаружено повышение по отношению к контролю уровня экспрессии мембранных рецепторов апоптотических сигналов CD95 лимфоцитов, суспендированных в питательной среде RPMI-1640 и растворе Хенкса, в течение 1-5 ч после УФ-облучения клеток в использованных дозах. Увеличение экспрессии Fas-рецепторов лимфоцитов, модифицированных воздействием УФ-света, в растворе Хенкса связано не только с демаскированием ранее недоступных (скрытых) молекул СD95, но и с синтезом их новых молекул через 4 и 5 ч после облучения иммуноцитов.

Выявлено повышение по сравнению с контролем уровня функциональной активности инициирующих каспаз-8 и -12 соответственно через 3 ч после УФ-облучения лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2 и сразу после их фотомодификации. Полученные данные указывают на возможность участия этих каспаз в осуществлении рецепторного каспазного пути (каспаза-8) и сигнальных путей, связанных с нарушением кальциевого гомеостаза и изменением уровня вторичных мессенджеров — Ca2+ и цАМФ (каспаза-12).

Обнаружено повышение уровня функциональной активности эффекторной каспазы-3 лимфоцитов человека по отношению к таковому для интактных образцов через 8 и 24 ч и 6 и 8 ч соответственно после облучения клеток в дозах 151 и 1510 Дж/м2. УФ-модификация лимфоцитов в дозе 3020 Дж/м2 индуцирует инактивацию каспазы-3.

Установлено, что после 20 ч инкубации лимфоцитов, УФ-облученных в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2, происходит фрагментация ДНК, на что указывает совокупность полос («апоптозная лестница») на электрофореграмме, соответствующая фрагментам ДНК меньшего размера по сравнению с контролем.

Повреждения ДНК (однонитевые разрывы) обнаруживаются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 (ДНК-кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и С3). Вероятно, накопление однонитевых разрывов ДНК приводит в итоге к формированию двунитевых разрывов. Двунитевые разрывы ДНК являются сигналом к запуску апоптоза, осуществляющегося с участием транкрипционного фактора р53, проапоптозного белка Bax и других митохондриальных факторов апоптоза. Изменения структурного состояния митохондриальных мембран были выявлены после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2.

Через 20 ч после облучения лимфоцитов в дозе 151 Дж/м2 обнаружены фрагменты ДНК с размерами 6000 п.н. и менее 1500 п.н. Использование метода ДНК-комет в этих условиях позволило выявить кометы класса С2, характерные для предапоптотических клеток (фрагменты ДНК  50 т.п.н.).

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 1510 Дж/м2 зарегистрировано образование фрагментов ДНК менее 1500 п.н. и ДНК-комет С3-класса, что указывает на межнуклеосомную фрагментацию ДНК, характерную для погибающих клеток.

Через 20 ч после воздействия на лимфоциты УФ-света в дозе 3020 Дж/м2 обнаружены фрагменты ДНК размером примерно 5000 п.н. и менее 1500 п.н., кометы С3- и С4-классов. В этих же условиях наблюдалась инактивация каспазы-3. По-видимому, эти результаты указывают на возможность реализации р53-зависимого пути апоптоза, сопровождающегося выходом из митохондрий AIF (фактора, индуцирующего апоптоз), и индукцией каспазонезависимого пути программированной клеточной смерти.

Предположение о возможности участия р53 в осуществлении апоптоза лимфоцитов было подтверждено после обнаружения (по сравнению с интактными иммуноцитами) более высокого уровня этого белка через 6 ч после облучения клеток в дозах 1510 и 3020 Дж/м2.

В пользу представлений о запуске митохондриального механизма апоптоза свидетельствуют данные по определению уровня активных форм кислорода в УФ-облученных лимфоцитах. Выявлено, что УФ-облучение иммуноцитов и последующая инкубация в течение 1 и 2 ч индуцировали повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода по сравнению с контрольными образцами.

На основании результатов определения уровня цитохрома с в цитозоле лимфоцитов через 1,5 и 4 ч после УФ-облучения клеток предполагается возможность участия цитохрома с в осуществлении программированной клеточной смерти лимфоцитов человека, индуцированной воздействием УФ-света в минимальной из использованных доз (151 Дж/м2).

В ходе проведения проточно-цитометрического анализа лимфоцитов после их УФ-облучения в дозе 1510 Дж/м2 выявлены временные характеристики реализации апоптотической гибели клеток. Время – 2-4 ч после фотомодификации клеток, достаточно для осуществления основных событий программированной клеточной смерти, сопровождающихся транслокацией фосфатидилсерина во внешний монослой плазматической мембраны лимфоцитов (большая часть клеток в суспензии находится на ранней стадии апоптоза).

Следовательно, гибель лимфоцитов крови человека, индуцированная воздействием УФ-света, реализуется с участием рецепторного, ядерного (р53-зависимого пути) и митохондриального механизмов апоптоза.

Mechanisms of UV-induced cell death of human lymphocytes

M.N. Nakvasina1,2*, V.A. Artyukhov1,2, M.R. Radchenko1,2

1.Department of Biophysics and Biotechnology;
2.Voronezh State University;

* nakvasina_ma(at)mail.ru

One of the key problems of cell biophysics is the identification of patterns of cell death as a fundamental general biological phenomenon. The study of the mechanisms of cell death, the identification of markers (indicators) of its types, the search for ways to regulate them is the key to understanding the regularities of the processes of morpho- and embryogenesis, maintaining cellular homeostasis, the biological action of physicochemical agents, the pathogenesis of various human diseases and the development of effective methods for their treatment.

The mechanisms and sequence of development and implementation of the stages of programmed cell death of peripheral blood lymphocytes of donors under exposure to UV light (240–390 nm) at doses of 151, 1510, and 3020 J/m2 were studied.

An increase in the level of expression of membrane receptors of apoptotic signals of CD95 lymphocytes suspended in the nutrient medium RPMI-1640 and Hank's solution was found to increase in relation to the control level within 1-5 hours after UV irradiation of cells at the doses used. An increase in the expression of Fas receptors of lymphocytes modified by exposure to UV light in Hank's solution is associated not only with the unmasking of previously inaccessible (hidden) CD95 molecules, but also with the synthesis of their new molecules 4 and 5 h after immunocyte irradiation.

An increase in the level of functional activity of initiating caspases-8 and -12, respectively, was found 3 hours after UV irradiation of lymphocytes at a dose of 1510 J/m2 and immediately after their photomodification. The data obtained indicate the possibility of participation of these caspases in the implementation of the receptor caspase pathway (caspase-8) and signaling pathways associated with impaired calcium homeostasis and changes in the level of second messengers - Ca2+ and cAMP (caspase-12).

An increase in the level of functional activity of the effector caspase-3 of human lymphocytes relative to that of intact samples was found 8 and 24 h and 6 and 8 h, respectively, after cell irradiation at doses of 151 and 1510 J/m2. UV modification of lymphocytes at a dose of 3020 J/m2 induces caspase-3 inactivation.

It was found that after 20 hours of incubation of lymphocytes irradiated with UV at doses of 151, 1510, 3020 J/m2, DNA fragmentation occurs, as indicated by a set of bands (“apoptotic ladder”) on the electropherogram, corresponding to smaller DNA fragments compared to the control. .

DNA damage (single-strand breaks) is detected immediately after UV irradiation of lymphocytes at doses of 1510 and 3020 J/m2 (C1 type DNA comets) and reaches a maximum 6 h after cell modification (C2 and C3 comets). Probably, the accumulation of DNA single-strand breaks eventually leads to the formation of double-strand breaks. DNA double-strand breaks are a signal to trigger apoptosis, which is carried out with the participation of the transcription factor p53, the pro-apoptotic Bax protein, and other mitochondrial apoptosis factors. Changes in the structural state of mitochondrial membranes were revealed after exposure of lymphocytes to UV light at doses of 151 and 1510 J/m2.

20 hours after irradiation of lymphocytes at a dose of 151 J/m2, DNA fragments with a size of 6000 bp were found. and less than 1500 b.p. The use of the DNA comet method under these conditions made it possible to identify class C2 comets characteristic of preapoptotic cells (DNA fragments  50 kb).

20 hours after exposure of lymphocytes to UV light at a dose of 1510 J/m2, the formation of DNA fragments less than 1500 bp was registered. and DNA comets of the C3 class, which indicates internucleosomal DNA fragmentation, which is characteristic of dying cells.

Twenty hours after exposure of lymphocytes to UV light at a dose of 3020 J/m2, DNA fragments of approximately 5000 bp in size were found. and less than 1500 bp, comets of C3- and C4-classes. Caspase-3 inactivation was observed under the same conditions. Apparently, these results indicate the possibility of implementing the p53-dependent pathway of apoptosis, accompanied by the release of AIF (apoptosis-inducing factor) from mitochondria and the induction of a caspase-independent pathway of programmed cell death.

The assumption that p53 may be involved in apoptosis of lymphocytes was confirmed after the discovery (compared to intact immunocytes) of a higher level of this protein 6 h after cell irradiation at doses of 1510 and 3020 J/m2.

In favor of the concept of triggering the mitochondrial mechanism of apoptosis is evidenced by data on determining the level of reactive oxygen species in UV-irradiated lymphocytes. It was found that UV irradiation of immunocytes and subsequent incubation for 1 and 2 hours induced an increase in the intracellular level of reactive oxygen species compared to control samples.

Based on the results of determining the level of cytochrome c in the cytosol of lymphocytes 1.5 and 4 hours after UV irradiation of cells, it is assumed that cytochrome c may be involved in the programmed cell death of human lymphocytes induced by exposure to UV light at the minimum dose used (151 J/m2 ).

During the flow cytometric analysis of lymphocytes after their UV irradiation at a dose of 1510 J/m2, time characteristics of the implementation of apoptotic cell death were revealed. The time is 2–4 h after cell photomodification, which is sufficient for the implementation of the main events of programmed cell death, accompanied by the translocation of phosphatidylserine into the outer monolayer of the plasma membrane of lymphocytes (most of the cells in suspension are at an early stage of apoptosis).

Therefore, the death of human blood lymphocytes induced by exposure to UV light is realized with the participation of the receptor, nuclear (p53-dependent pathway), and mitochondrial mechanisms of apoptosis.



Докладчик: Наквасина М.Н.
20
2022-10-31

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists