Эффективная заморозка и хранение сперматозоидов человека является крайне актуальной задачей для вспомогательных репродуктивных технологий. Несмотря на то, что криоконсервация сперматозоидов проводится с 1960-ых годов, до сих подвижность и оплодотворяющая способность клеток после криоконсервации уменьшается в среднем на 30–70% [1]. В настоящий момент составы криопротекторных сред подбираются эмпирически, основываясь на наблюдениях за показателями клеток без глубокого понимания физико-химических процессов, происходящих в конкретных растворах при низких температурах и влияния на эти процессы скоростей и режимов заморозки.



Поэтому целью работы является изучение влияния различных компонент криопротекторных сред и условий заморозки на процесс кристаллообразования в криопротекторных средах, а также подбор оптимального состава криопротекторной среды и режима заморозки, повышающего выживаемость клеток.



Для получения зависимости теплоемкости от температуры был использован калориметр PPMS (Physical Property Measurement System, Quantum Design, Inc., USA) [2]. Оценка влияния на кристаллообразование добавления отдельных компонент, а также различных режимов заморозки была проведена с помощью рентгеноструктурного анализа (DESY, Германия).



В результате проведенных экспериментов были получены зависимости теплоемкости от температуры для буферного раствора глицерина (12%об.) с поэтапным добавлением альбумина (4 мг/мл) и сахарозы (0,5 М). Основным результатом калориметрических измерений стал вывод о том, что добавление сахарозы к водному раствору глицерина уменьшает температурный промежуток между температурой плавления и температурой стеклования, что может способствовать лучшей выживаемости клеток.



Первые эксперименты с помощью рентгеноструктурного анализа были проведены для базовых растворов малых объемов (20-30 мкл), чтобы продемонстрировать возможность использования данного метода для изучения процесса кристаллообразования. Были получены дифракционные картины для водно-глицеринового раствора (50% об.), воды (100%) и исследуемого раствора (12% об. глицерина). Однако, в настоящее время в клиниках при работе со сперматозоидами чаще всего используется метод медленной заморозки больших объемов образцов. Поэтому дальнейшее изучение процесса образования кристаллов льда в криопротекторных растворах было проведено для образцов объемом 1,7 мл. Для оценки средних размеров кристаллов, формирующихся в растворе при криоконсервации, было написано программное обеспечение, позволяющее численно оценить средние размеры кристаллов. С помощью данной программы были получены размеры средних кристаллов для базовых растворов при замораживании в больших объемах. Показано, что средний размер кристаллов в растворе со всеми компонентами составляет 8±1 мкм, а для водного раствора сахарозы (0,5М) без глицерина 20±2 мкм. Также было обнаружено, что добавление сахарозы приводит к увеличению числа кристаллов в растворе, но их размеры значительно меньше. Данное наблюдение коррелирует с предполагаемой функцией непроникающих компонент, а также подтверждает результаты, полученные ранее методом калориметрии.



В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что кристаллообразование в образцах объемом 1,7 мл происходит неоднородно при классической вертикальной заморозке. В связи с этим был предложен альтернативный метод заморозки сперматозоидов с горизонтальным расположением пробирки. Для этого на 3D-принтере был изготовлен держатель, позволяющий адаптировать метод заморозки, используемый в клиниках. Было показано, что средние размеры кристаллов для коммерческого криопротектора SpermFreeze при вертикальном расположении в верхней и нижней части пробирки составляют соответственно 13 и 8 мкм. При горизонтальном положении процесс формирования кристаллов происходит более однородно и средний размер формирующихся кристаллов меньше, а именно 10 и 8 мкм в верхней и нижней части пробирки. Вывод об однородности формирования кристаллов при горизонтальном расположении пробирки был также подтвержден статистически для всех изучаемых растворов.



Таким образом, методами адиабатической калориметрии и рентгеноструктурного анализа показано, что добавление сахарозы к водному раствору глицерина при замораживании в малых объемах уменьшает температурный промежуток между температурой плавления и температурой стеклования, а также уменьшает размер формирующихся кристаллов. В работе с помощью предложенного нового метода анализа дифракционных картин для криопротекторных сред были численно оценены размеры кристаллов для всех изучаемых криопротекторных сред. Также было продемонстрировано, что формирование кристаллов при вертикальном размещении образцов во время заморозки происходит неравномерно, разброс их величины может достигать 20 мкм и более, в то время как горизонтальное расположение статистически значимо приводит к более однородному формированию кристаллов внутри образца. На основании полученных результатов был разработан и предложен новый метод заморозки сперматозоидов в криопробирках с горизонтальным расположением образцов при криоконсервации.



1. Libo S. P., Picton H. M., and Godson R. G., In Current Practices and Controversis in Assisted Reproduction, World Health Organization, Geneva, 2001, p. 152–165

2. E. Yu. Simonenko, V.V.Pryadun, A.A.Ivanova, E.V. Burmistrova, A.N. Vasiliev, S.A. Yakovenko, An Adiabatic Calorimetry Method to Determine the Thermodynamic Characteristics of Cryoprotectants, 2019, Vol.64, No. 1, p.1-6

Efficient freezing and storage of human sperm is an extremely urgent task for assisted reproductive technology. Despite the fact that sperm cryopreservation has been performed since the 1960s, the motility and fertilizing capacity of cells after cryopreservation is still reduced by an average of 30-70% [1]. Currently, the compositions of cryoprotective media are selected empirically, based on observations of the cell parameters without a deep understanding of the physical and chemical processes occurring in specific solutions at low temperatures and the effect of freezing rates and modes on these processes.



Therefore, the purpose of this work is to study the effect of different components of cryoprotective media and freezing conditions on the process of crystal formation in cryoprotective media, as well as to select the optimal composition of cryoprotective medium and freezing conditions that increase the survival of cells.



A PPMS (Physical Property Measurement System, Quantum Design, Inc., USA) calorimeter was used to obtain the dependence of heat capacity on temperature [2]. Evaluation of the effect on the crystal formation of the addition of individual components, as well as different modes of freezing was carried out using X-ray diffraction analysis (DESY, Germany).



The experiments resulted in temperature dependences of heat capacity for glycerol buffer solution (12% vol.) with stepwise addition of albumin (4 mg/ml) and sucrose (0.5 M). The main result of the calorimetric measurements was the conclusion that the addition of sucrose to the aqueous glycerol solution reduces the temperature gap between the melting temperature and the glass transition temperature, which may contribute to better cell survival.



The first experiments using X-ray diffraction analysis were performed for base solutions of small volumes (20-30 µl) to demonstrate the possibility of using this method to study the process of crystal formation. Diffraction patterns were obtained for water-glycerol solution (50% vol.), water (100%), and the solution under study (12% vol. glycerol). However, at present clinics when working with spermatozoa most often use the method of slow freezing of large volumes of samples. Therefore, further study of ice crystal formation in cryoprotective solutions was performed for 1.7 ml samples. In order to estimate the average size of crystals formed in solution during cryopreservation, software was written to numerically estimate the average size of crystals. Using this software, average crystal sizes were obtained for basic solutions during large volume freezing. It was shown that the average crystal size in the solution with all components was 8±1 μm, and for an aqueous solution of sucrose (0.5M) without glycerol 20±2 μm. It was also found that the addition of sucrose leads to an increase in the number of crystals in solution, but their size is much smaller. This observation correlates with the putative function of the non-penetrating components and also confirms the results obtained earlier by calorimetry.



In the course of experiments, it was found that crystal formation in 1.7 ml samples occurs inhomogeneously during classical vertical freezing. Therefore, an alternative method of sperm freezing with a horizontal position of the test tube was proposed. For this purpose, a holder was made on a 3D printer to adapt the freezing method used in clinics. It was shown that the average crystal sizes for the commercial cryoprotectant SpermFreeze when vertically positioned at the top and bottom of the tube are 13 and 8 μm, respectively. In the horizontal position, the crystal formation process is more uniform and the average size of the formed crystals is smaller, namely 10 and 8 μm at the top and bottom of the tube. The conclusion about homogeneity of crystal formation when the tube is placed horizontally was also confirmed statistically for all studied solutions.



Thus, the methods of adiabatic calorimetry and X-ray analysis show that the addition of sucrose to the aqueous glycerol solution during freezing in small volumes reduces the temperature interval between the melting temperature and the glass transition temperature, and also reduces the size of the forming crystals. In this work, using the proposed new method of diffraction pattern analysis for cryoprotective media, crystal sizes were numerically estimated for all cryoprotective media under study. It was also demonstrated that the formation of crystals when samples are placed vertically during freezing occurs unevenly, the scatter of their size can reach 20 μm or more, while the horizontal arrangement statistically significantly leads to more homogeneous crystal formation within the sample. Based on the results obtained, a new method of sperm freezing in cryotubes with horizontal arrangement of samples during cryopreservation was developed and proposed.



1. Libo S. P., Picton H. M., and Godson R. G., In Current Practices and Controversis in Assisted Reproduction, World Health Organization, Geneva, 2001, p. 152-165

2. E. Yu. Simonenko, V.V. Pryadun, A.A. Ivanova, E.V. Burmistrova, A.N. Vasiliev, S.A. Yakovenko, An Adiabatic Calorimetry Method to Determine the Thermodynamic Characteristics of Cryoprotectants, 2019, Vol.64, No. 1, p.1-6