VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Механизмы действия физико-химических факторов на биологические системы

Электрохимическое исследование поведения толуидинового синего в альгинатном гидрогеле с иммобилизованными клетками перитонеального смыва

М.В. Новаковская1*, И.А. Черенков1, Е.И. Рябов1

1.Удмуртский государственный университет, Ижевск, Россия;

* mariya.98(at)inbox.ru

В настоящее время существует потребность в разработке модели активации, дифференцировки и оценки функциональной активности клеток иммунной системы. Такая модель с гетерогенным клеточным составом может стать основой микрофизиологической системы «воспаление-на-чипе» и использоваться как для углубления представлений о клеточных механизмах воспаления и факторов его вызывающих, так и с прикладными целями – для тестирования противовоспалительных лекарственных субстанций.

Основу работы составило проведение серии электрохимических измерений на планарных графитовых электродных системах (рабочий и вспомогательный электроды – графитовые, электрод сравнения - хлорсеребряный), которые предназначены для работы с малыми объёмами.

Измерялись значения силы тока, потенциалов для основных электрохимических процессов (окисление и восстановление красителя), а также характерные свойства вольтамперных кривых циклической вольтамперометрии (ЦВА).

Перед измерениями электроды подвергали циклированию в диапазоне потенциалов от -1000 до 1000 мВ дистиллированной водой для стабилизации характеристик. В качестве фонового электролита использовался 0,9% раствор хлорида натрия (рН = 6,8). На его основе готовились все последующие растворы. Для моделирования межклеточного матрикса использовался 2% (масс.) свежеприготовленный альгинат натрия (ρ = 997 кг/м3). Его полимеризация осуществлялась в течение 5 минут 0,1М раствором CaCl2 (ρ = 1018 кг/м3), который наносился непосредственно на рабочий электрод, избыток раствора удалялся фильтровальной бумагой. В качестве электроактивной метки, дающей аналитический сигнал, был выбран краситель – толуидиновый синий (ТС) в концентрации 0,1мМ.

Лейкоциты выделяли из перитонеального смыва мышей. Взвесь клеток отмывали стерильным физиологическим раствором (ФР). Суспензию смешивали с 4% альгинатом натрия (масс.) в соотношении 1:1 и исследовали методом ЦВА в диапазоне потенциалов 0…+500 мВ (отн. Ag/AgCl) со скоростью развертки потенциала 35 мВ/с.

Для оценки диффузии красителя в бесклеточной и клеточной системах измерения проводились в течение 50 минут с интервалом в 5 минут.

В присутствии 2% альгината ТС характеризуется близким к обратимому электрохимическому поведению. Наблюдаются качественные изменения вольтамперных кривых ЦВА. До начала измерений краситель формирует два пика: при потенциале +280,2мВ – пик восстановления (Ерс), а при +203,9 мВ – пик окисления (Ера), ΔЕ = 76,3 мВ. Что касается значений пиковых токов, то они соответствуют +0,11 мкА для восстановления (Ipс) и -0,14 мкА для окисления (Ipа). Отличные значения потенциалов и схожие по модулю значения пиковых токов указывают на квазиобратимый процесс, который обусловлен наличием полианионного гидрогеля в системе, препятствующего осаждению заряженных молекул красителя.

В течение 30 минут мы наблюдали постепенное нарастание пиковых значений силы тока. На последнем цикле они составили Ipс = 0,23 мкА, Ipа = -0,15 мкА. Отношение пиковых значений силы тока составляет 0,65 мкА, что говорит о частичной обратимости процесса. Интерес представляли значения потенциалов соответствующих пиков: Ерс = +316,2 мВ, Ера = + 196 мВ, ΔЕ = 120,2 мВ. Мы предположили, что такое поведение красителя связано с его частичной абсорбцией в гидрогеле, так как низкие концентрации CaCl2 обеспечили не полную полимеризацию гидрогеля. Из-за чего структура капли была рыхлой, а внутри неё и на поверхности было достаточно реакционноспособных свободных группировок.

На основе уравнения Рендлса-Шевчика был рассчитан коэффициент диффузии красителя через альгинатный гидрогель и составил D = 1,18 * 10-9 м2/c. Такой результат является более низким по сравнению с оценочными значениями коэффициента диффузии ТС для водных сред, полученных по данным расчетов на основе приближения Стокса-Эйнштейна, приведенных в литературе (1,42 * 10−9 м2/c). Альгинатный гидрогель, стабилизированный ионами кальция, замедляет диффузию ТС.

После добавления в электрохимическую ячейку клеточного компонента нами были зафиксированы видимые изменения. В присутствии клеток системой изначально сформировалось 2 пика: Ipс = + 0,02 мкА при Ерс = +272,3 мВ, Ipа = -0,01 мкА при Ера = + 239,9 мВ. Значения силы тока по сравнению с контролем уменьшились более, чем в 10 раз, что указывает на присутствие клеточного компонента в системе, который активно взаимодействует с красителем.

Через 30-минутной диффузии ТС наблюдается значительное повышение пиковых значений силы тока Ipс = + 0,2 мкА, Ipа = -0,28 мкА, Ipа/Ipс= 1,4. Также смещается и диапазон потенциалов, в котором происходят превращения красителя (Еpс = 308,3 мВ, Еpа = 183,8 мВ, ΔЕ = 124,5 мВ).

Зависимость пиковых значений силы тока от времени являлась линейной и описывалась уравнением: Ipс = t + 0,31, R2 = 0,99. Коэффициент диффузии D = 2,47 * 10-11 м2/c, что значительно ниже по сравнению с бесклеточной моделью.

В обеих системах также было отмечено преобладание катодного тока над анодным, что объясняется наличием восстанавливающихся электроактивных молекул. В присутствии клеток увеличились значения токов электроокисления, что указывает на наличие окисленных молекул, в качестве которых могут выступать активные формы кислорода, выделенные лейкоцитами.

Таким образом, нами была установлена функциональная активность лейкоцитов, выраженная в значениях каталитических токов окислительно-восстановительных превращений ТС. Взаимодействие клеток перитонеального смыва с компонентами электрохимической модели запускает биохимический каскад реакций, которые успешно регистрируются методом ЦВА. Это позволяет смоделировать процесс взаимодействия клеток с межклеточным матриксом и в дальнейшем проследить этапы переноса электронов в тканевых системах.

Electrochemical study of the behavior of toluidine blue in alginate hydrogel with immobilized peritoneal lavage cells

M.V. Novakovsraya1*, I.A. Cherenkov1, E.I. Ryabov1

1.Udmurt State University, Izhevsk, Russia;

* mariya.98(at)inbox.ru

Currently, there is a need to develop a model for the activation, differentiation, and evaluation of the functional activity of cells of the immune system.Such a model with a heterogeneous cellular composition can become the basis of the “inflammation-on-a-chip” microphysiological system and be used both to deepen our understanding of the cellular mechanisms of inflammation and its causative factors, and for applied purposes – to test anti-inflammatory medicinal substances.

The basis of the work was a series of electrochemical measurements on planar graphite electrode systems (working and auxiliary electrodes - graphite, reference electrode - silver chloride), which are designed to work with small volumes.

The values of the current strength, potentials for the main electrochemical processes (oxidation and reduction of the dye), as well as the characteristic properties of the current-voltage curves of cyclic voltammetry (CV) were measured.

Before measurements, the electrodes were cycled in the potential range from –1000 to 1000 mV with distilled water to stabilize the characteristics. A 0.9% sodium chloride solution (рН = 6.8) was used as a supporting electrolyte. All subsequent solutions were prepared on its basis. To model the intercellular matrix, 2% (wt.) freshly prepared sodium alginate (ρ = 997 kg/m3) was used. Its polymerization was carried out for 5 minutes with a 0.1 M CaCl2 solution (ρ = 1018 kg/m3), which was applied directly to the working electrode, the excess solution was removed with filter paper. Toluidine blue (TB) at a concentration of 0.1 mM was chosen as an electroactive label giving an analytical signal.

Leukocytes were isolated from peritoneal lavage of mice. The cell suspension was washed with sterile saline (S). The suspension was mixed with 4% sodium alginate (wt.) in a ratio of 1:1 and studied by the CV method in the potential range of 0…+500 mV (rel. Ag/AgCl) with a potential sweep rate of 35 mV/s.

To assess the diffusion of the dye in cell-free and cellular systems, measurements were carried out for 50 minutes with an interval of 5 minutes.

In the presence of 2% alginate, TB is characterized by close to reversible electrochemical behavior. Qualitative changes in the current-voltage curves of the CV are observed. Prior to the start of measurements, the dye forms two peaks: at a potential of +280.2 mV, the reduction peak (Ерс), and at +203.9 mV, the oxidation peak (Ера), ΔЕ = 76.3 mV. As for the values ​​of peak currents, they correspond to +0.11 µA for reduction (Ipc) and -0.14 µA for oxidation (Ipа). The excellent potential values ​​and peak currents similar in absolute value indicate a quasi-reversible process, which is due to the presence of a polyanionic hydrogel in the system, which prevents the deposition of charged dye molecules.

Within 30 minutes, we observed a gradual increase in the peak values ​​of the current strength. At the last cycle, they amounted to Ips = 0.23 µA, Ipа = -0.15 µA. The peak current ratio is 0.65 μA, which indicates the partial reversibility of the process. The potential values ​​of the corresponding peaks were of interest: Ерс = +316.2 mV, Ера = + 196 mV, ΔЕ = 120.2 mV. We assumed that this behavior of the dye is due to its partial absorption in the hydrogel, since low concentrations of CaCl2 ensured incomplete polymerization of the hydrogel. Because of this, the structure of the drop was loose, and there were enough reactive free groups inside it and on the surface.

Based on the Rendles-Shevchik equation, the diffusion coefficient of the dye through the alginate hydrogel was calculated and amounted to D = 1.18 * 10-9 m2/s. This result is lower than the estimated values ​​of the diffusion coefficient TS for aqueous media, obtained from the calculations based on the Stokes-Einstein approximation, given in the literature (1.42 * 10−9 m2/s). Alginate hydrogel stabilized with calcium ions slows down the diffusion of TS.

After adding a cellular component to the electrochemical cell, we recorded visible changes. In the presence of cells, the system initially formed 2 peaks: Ipc = + 0.02 µA at Ерс = +272.3 mV, Ipа = -0.01 µA at Еpa = + 239.9 mV. The current strength values ​​decreased by more than 10 times compared to the control, which indicates the presence of a cellular component in the system that actively interacts with the dye.

After a 30-minute TB diffusion, a significant increase in the peak current strength is observed Ipc = + 0.2 μA, Ipа = -0.28 μA, Ipа/Ipс = 1.4. The range of potentials in which dye transformations take place also shifts (Epc = 308.3 mV, Epa = 183.8 mV, ΔE = 124.5 mV).

The dependence of the peak values ​​of the current strength on time was linear and described by the equation: Ipc = t + 0.31, R2 = 0.99. Diffusion coefficient D = 2.47 * 10-11 m2/s, which is significantly lower compared to the cell-free model.

In both systems, the predominance of the cathode current over the anode current was also noted, which is explained by the presence of recovering electroactive molecules. In the presence of cells, the values ​​of electrooxidation currents increased, which indicates the presence of oxidized molecules, which can be reactive oxygen species released by leukocytes.

Thus, we have established the functional activity of leukocytes, expressed in terms of catalytic currents of redox transformations of TS. The interaction of peritoneal lavage cells with the components of the electrochemical model triggers a biochemical cascade of reactions that are successfully recorded by the CV method. This makes it possible to simulate the process of cell interaction with the extracellular matrix and subsequently to trace the stages of electron transfer in tissue systems.


Докладчик: Новаковская М.В.
290
2022-10-31

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists