В клетках, подвергающихся воздействию ионизирующего излучения, активируется ряд сложных реакций, включающих повреждение и репарацию ДНК, гибель клеток, изменение уровня пролиферации. Эффекты действия высоких доз радиации на клетки млекопитающих изучались, в том числе, в аспекте активности генов и их регуляторов. Однако, остается менее исследованным, как малые дозы ионизирующего излучения (МДР) влияют на указанные процессы. Рядом авторов показано, что воздействие МДР приводит к различным положительным реакциям клетки и организма в целом: активация иммунной системы, генов и их регуляторов в феномене гормезиса, формирование адаптивного ответа. Эти наблюдения определили цель работы: исследовать активность генов и некодирующих РНК (длинных некодирующих РНК и микроРНК) в различных органах мышей с трансплантированной карциномой Льюиса при облучении в МДР при различных вариантах экранирования.

Материалы и методы:

Объектами исследования являлись мыши-самки С57Bl/6 с перевитой карциномой легких Льюиса, подверженные тотальному 4х кратному фракционированному рентгеновскому облучению в дозе 75 мГр на аппарате РУСТ М1 на 10-е сутки после трансплантации опухолевой ткани (мощность дозы 0,154 Гр/мин, сила тока 0,7 мА, напряжение 200 кВ). Облучение проводили с использованием защитных алюминиевых экранов различных областей тела мыши: тотальное (без экранирования), только опухоли (экранирование остального тела), всего организма без опухоли (экранирование опухоли). В соответствии с экранированными областями были сформированы группы мышей. Измерение опухоли у каждого животного производили каждый день, начиная с 11-х суток (когда объем опухоли был достаточно выражен) после введения клеток. На 21 сутки после инокуляции опухолевой ткани всех животных подвергали эвтаназии. Содержание мРНК белок кодирующих генов, а также некодирующих РНК (микроРНК, длинных некодирующих РНК) оценивали в костном мозге, гомогенате селезенки и тимуса, а также в карциноме легких Льюиса методом ПЦР в реальном времени. Последовательность праймеров и условия ПЦР в реальном времени опубликованы ранее. В качестве конститутивного гена для оценки экспрессии был использован ген GAPDH. Результаты представляли в виде медианы изменения экспрессии показателей в группах облученных мышей, выраженных по отношению к медиане группы контроля, принятой за единицу. Для оценки статистический значимости применялся непараметрический критерий Манна-Уитни (p<0,05).

Результаты

Обнаружено, что рост опухоли происходит экспоненциально во всех экспериментальных группах, начиная с 11 суток. Однако в группе мышей с тотальным облучением животного объем опухоли имеет бо́льшие размеры по сравнению с другими группами, в то время как в группе мышей с экранированием опухоли объем новообразований наименьший на аналогичных сроках измерения.

Показано, что при действии 4-х кратного фракционированного тотального облучения в дозе 75 мГр на мышей с перевивной карциномой Льюиса в гомогенате опухоли происходит статистически значимое изменение экспрессии мРНК генов NFkB, G-CSF, TNFα, iNOS по сравнению как с необлученным контролем, так и с группой тотального облучения тела животного.

При анализе экспрессии генов и некодирующих РНК в образцах тимуса, селезенки и костного мозга мышей получено, что наибольшее количество активированных показателей (экспрессия статистически значимо изменилась в ответ на облучение), было выявлено для селезенки (40% – при тотальном облучении – 50% при локальном облучении только опухоли, 30% – при экранировании опухоли). Эти результаты согласуются с литературными данными, в которых показано, что тимус и костный мозг являются более пролиферирующими органами, клетки которых по большей части находятся в митозе, что отражается в сниженной транскрипции генов, по сравнению с селезенкой.

Из 20 исследованных нами показателей, наибольшая модуляция экспрессии (в 3 и более раз) была выявлена для мРНК генов G-CSF (3,12 раз), IAP (4,3 раз), P38 (в 3,12 раза) и длинных некодирующих РНК lncp21 (в 3,7 раза), NEAT (6 раз). Однако линейность влияния величины модуляции экспрессии на оказываемый биологический эффект еще предстоит исследовать.

При использовании экранирования карциномы Льюиса мышей выявленные изменения в экспрессии NFkB(p50), G-CSF, TNFα, iNOS, lncp21 в самой опухоли были практически одинаковыми как в случае локального воздействия ИИ в малой дозе (группа «обл.только опухоль»), так при тотальном облучении без опухоли по сравнению с контролем. Однако, только для мРНК гена Р38 нами показано статистически значимое изменение в группе «облучение без опухоли» и его отсутствие при локальном облучении (группа «обл.только опухоль»).

Заключение

Полученные результаты экспрессии генов в опытах с применением экранирования свидетельствуют о разных уровнях активации иммунной системы в зависимости от вида экранирования. Данные выводы подтверждают снижение роста опухоли у животных, подвергшихся воздействию тотального рентгеновского облучения с экранированной опухолью по сравнению с другими экспериментальными группами. Полученные результаты не являются окончательными и требуют дальнейшей экспериментальной работы.

A number of complex reactions are activated in cells exposed to ionizing radiation, including DNA damage and repair, cell death, and changes in proliferation levels. The effects of high doses of radiation on mammalian cells have been studied including the activity of genes and their regulators. However, how low doses of ionizing radiation (LDR) influence these processes remains less studied. A number of authors have shown that exposure to LDR leads to various positive reactions of the cell and the organism as a whole: activation of immune system, genes and their regulators in the phenomenon of hormesis, formation of adaptive response. These observations determined the purpose of the work: the studying of the activity of genes and non-coding RNAs (long non-coding RNAs and microRNAs) in different organs of mice with transplanted Lewis carcinoma after LDR irradiation under different shielding variants.

Materials and Methods. Female mice C57Bl/6 with transplanted Lewis lung carcinoma cells exposed to total 4x fractionated X-ray irradiation at a dose of 75 mGy on the RUST M1 on 10th after tumor tissue transplantation (dose rate 0.154 Gy/min, current strength 0.7 mA, voltage 200 kV). The irradiation was performed using protective aluminum shields of different areas of mouse body: total (no shielding), tumor only (shielding of the rest of the body), the whole body without tumor (tumor shielding). Groups of mice were formed according to the screened areas. The tumor in each animal was measured every day, starting on day 11 (when the tumor volume was sufficiently pronounced) after cell injection. On 21 days after tumor tissue inoculation, all animals were euthanized. The mRNA content of protein-coding genes as well as non-coding RNAs (microRNAs, long non-coding RNAs) was assessed in bone marrow, spleen and thymus homogenate, and Lewis lung carcinoma by real-time PCR. The primer sequence and real-time PCR conditions have been published previously. The GAPDH gene was used as the constitutive gene to assess expression. The results were presented as median changes in expression of the indicators in the groups of irradiated mice, expressed relative to the median of the control group, taken as a unit. The nonparametric Mann-Whitney test (p<0.05) was used to assess statistical significance.

Results. Tumor growth was found to occur exponentially in all experimental groups starting from 11th day. However, in the group of mice with total irradiation of the animal the tumor volume was larger compared to other groups, while in the group of mice with tumor shielding the volume of neoplasm was the smallest at similar measurement periods. It was shown that a statistically significant change in mRNA expression of NFkB, G-CSF, TNFα, iNOS genes was observed in the tumor homogenate during 4-fold fractionated total irradiation in the dose of 75 mGy for mice with transplanted Lewis carcinoma as compared to both the unirradiated control and the total irradiation group of the animal body. Analysis of gene and non-coding RNA expression in samples of thymus, spleen and bone marrow of mice revealed that the highest number of activated indicators (expression changed statistically significantly in response to irradiation), was found for the spleen (40% - for total irradiation - 50% for local irradiation of tumor only, 30% - for tumor shielding). These results are consistent with literature data showing that the thymus and bone marrow are more proliferative organs, whose cells are mostly in mitosis, which is reflected in reduced gene transcription, compared to the spleen. Of the 20 parameters we studied, the highest modulation of expression (3 or more times) was detected for mRNAs of G-CSF (3.12 fold), IAP (4.3 fold), P38 (3.12 fold) and long non-coding RNAs lncp21 (3.7 fold), NEAT (6 fold). However, the linearity of the effect of the magnitude of expression modulation on the biological effect still remains to be investigated. When shielding Lewis carcinoma of mice, the detected changes in the expression of NFkB(p50), G-CSF, TNFα, iNOS, lncp21 in the tumor itself were almost identical both in case of local low-dose II exposure and total irradiation without tumor compared to the control. However, only for P38 gene mRNA we showed a statistically significant change in the "irradiation without tumor" group and its absence in the case of local irradiation.

Conclusion. The gene expression results obtained in the experiments with shielding indicate different levels of immune system activation depending on the type of shielding. These findings support a reduction in tumor growth in animals exposed to total x-ray irradiation with shielded tumor compared to other experiments.