Настоящая работа посвящена изучению влияния соединения АИКАР на выживаемость мышей, частоту микроядер в клетках костного мозга мышей и экскрецию внеклеточной ядерной и митохондриальной ДНК с мочой у крыс, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения.

Поиски путей модификации радиочувствительности являются важнейшей фундаментальной проблемой, как с позиции снижения последствий воздействия ионизирующих излучений (ИИ) на организм, так и с позиции повышения эффективности радиотерапии опухолей. Эффективность функционирования репарационных систем зависит не только от их полноценности, но и от количества индуцируемых повреждений ДНК, их сложности, а также энергообеспеченности развития ответа на повреждение ДНК (ОПД). При этом ключевую роль в поддержании энергетического гомеостаза в облученных малыми и сублетальными дозами ИИ клетках играет 5’-АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK). AMPK является полисубъединичным (гетеротримерным) комплексом – главным регулятором клеточного и системного энергетического гомеостаза. В ряде исследований показано, что дополнительной активации AMPK и митохондриального биогенеза в клетках удается достичь с помощью фармакологических соединений разного класса. Среди них значительный интерес представляет 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-рибоза (АИКАР), аналог АМФ, который транспортируется в клетки и широко используется в экспериментах.

Целью нашей работы явилась изучение влияния соединения АИКАР на выживаемость мышей и на частоту образования микроядер (МЯ) в клетках костного мозга, а также на экскрецию внеклеточной ядерной ДНК (вк-яДНК) и внеклеточной митохондриальной ДНК (вк-мтДНК) с мочой крыс, облученных рентгеновскими лучами.

Материалы и методы:

В исследовании использовались самцы мышей линии Balb/c 2-х месячного возраста и самцы крыс линии Fisher-344 3-х месячного возраста, полученных из питомника филиала Института биоорганической химии РАН (Пущино, Московская область). Для определения выживаемости мышей облучение проводили в дозе 8 Гр, а для анализа возникновения МЯ в клетках костного мозга в дозе 2 Гр. Крыс подвергали облучению в дозе 5 Гр. АИКАР (Merck, Darmstadt, Germany) вводили животным внутрибрюшинно по 400 мг/кг веса тела. Препарат вводили за 30 мин до и через 20 мин, 6 ч, 24 ч после облучения. Кривые выживаемости были получены для 30 животных на каждую кривую в каждом независимом эксперименте. Статистические различия в экспериментах на выживание между группами мышей сравнивались по методу Каплана-Майера. Различия между данными, полученными до и после обработки крыс, анализировали с помощью теста Манна-Уитни U или непарного t-критерия Стьюдента. Данные представлены в виде средней величины (для 8 животных) и стандартной ошибки среднего значения (±SEM). Значение p<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты:

Результаты показали, что АИКАР оказывает радиопротекторное действие, как по выживаемости мышей, так и по снижению частоты микроядер. Показано, что АИКАР оказывает значительный радиозащитный эффект только при его введении мышам сразу после облучения. Результаты анализов указывают, что радиомитигаторный эффект АИКАР на облученных животных, возможно, проявляется посредством митохондриально-направленного механизма. Данные по анализу экскреции вк-яДНК и вк-мтДНК с мочой облученных животных позволяют предполагать, что АИКАР также способствует ускоренному удалению поврежденных клеток и дисфункциональных митохондрий из тканей облученных животных посредством активации аутофагии (митофагии).

Заключение:

Таким образом, результаты наших исследований показывают, что АИКАР действует как радиомитигаторный эффектор и имеет высокий потенциал в качестве радиозащитного средства для активного практического применения.

The present work is devoted to the study of the effect of the AICAR compound on the survival rate of mice, the frequency of micronuclei in mouse bone marrow cells, and the urinary excretion of extracellular nuclear and mitochondrial DNA in rats exposed to X-rays.

The search for ways to modify radiosensitivity is the most important fundamental problem, both from the standpoint of reducing the effects of ionizing radiation (IR) on the body, and from the standpoint of increasing the effectiveness of tumor radiotherapy. The efficiency of the functioning of repair systems depends not only on their usefulness, but also on the amount of induced DNA damage, their complexity, as well as the energy supply for the development of a response to DNA damage (DNA). At the same time, 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) plays a key role in maintaining energy homeostasis in cells irradiated with low and sublethal doses of IR. AMPK is a polysubunit (heterotrimeric) complex, the main regulator of cellular and systemic energy homeostasis. A number of studies have shown that additional activation of AMPK and mitochondrial biogenesis in cells can be achieved using pharmacological compounds of various classes. Among them, of considerable interest is 5-aminoimidazole-4-carboxamide-ribose (AICAR), an AMP analog that is transported into cells and is widely used in experiments.

The aim of our work was to study the effect of the AICAR compound on the survival of mice and on the frequency of formation of micronuclei (MN) in bone marrow cells, as well as on the excretion of cell-free nuclear DNA (cf-nDNA) and cell-free mitochondrial DNA (cf-mtDNA) with the urine of rats irradiated X-rays.

Materials and methods

The study used male Balb/c mice 2 months old and male Fisher-344 rats 3 months old, obtained from the nursery of the branch of the Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Pushchino, Moscow region). To determine the survival of mice, irradiation was performed at a dose of 8 Gy, and to analyze the occurrence of MR in bone marrow cells, at a dose of 2 Gy. Rats were irradiated at a dose of 5 Gy. AICAR (Merck, Darmstadt, Germany) was administered to animals intraperitoneally at 400 mg/kg of body weight. The drug was administered 30 min before and 20 min, 6 h, 24 h after irradiation. Survival curves were generated for 30 animals per curve in each independent experiment. Statistical differences in survival experiments between groups of mice were compared using the Kaplan-Meier method. Differences between data obtained before and after treatment of rats were analyzed using the Mann-Whitney U test or unpaired Student's t-test. Data are presented as mean (for 8 animals) and standard error of the mean (±SEM). A p<0.05 value was considered statistically significant.

Results

The results showed that AICAR has a radioprotective effect, both in mouse survival and in reducing the frequency of micronuclei. It has been shown that AICAR has a significant radioprotective effect only when it is administered to mice immediately after irradiation. The results of the analyzes indicate that the radiomitigatory effect of AICAR on irradiated animals may be manifested through a mitochondria-targeted mechanism. Data on the analysis of cf-nDNA and cf-mtDNA excretion with the urine of irradiated animals suggest that AICAR also promotes the accelerated removal of damaged cells and dysfunctional mitochondria from the tissues of irradiated animals through the activation of autophagy (mitophagy).

Conclusion

Thus, the results of our studies show that AICAR acts as a radiomitigator effector and has a high potential as a radioprotective agent for active practical use.