Люцифераза светляков катализирует окисление D-люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и ионов магния, которое сопровождается биолюминесценцией в области 450 - 600 нм. В нашей лаборатории получены различные мутантные формы термостабильной люциферазы светляков Luciola mingrelica, отличающиеся по спектрам биолюминесценции, которые успешно применены в качестве высокочувствительных белковых маркеров для изучения специфических межмолекулярных взаимодействий в методах молекулярной диагностики. Достоинством биолюминесцентных систем является отсутствие фонового сигнала и простота детекции - они не требуют источника возбуждающего излучения. Использование термостабильной люциферазы дает возможность проводить исследования при 37°С и выше без изменения активности фермента внутри и вне клеток в течение длительного времени, что открывает большие возможности для работы с живыми клетками.

Люцифераза как маркер внутриклеточных процессов. Тест-системы на основе живых прокариотических и эукариотических клеток, продуцирующих термостабильную люциферазу светляков, могут быть использованы для изучения любых внешних факторов физической и химической природы, влияющих на их функционирование. Биолюминесцентные клетки позволяют регистрировать начальные стадии изменения проницаемости клеточной мембраны и оценивать степень повреждения клеток в присутствии мембрано-активных соединений, что является одним из критериев их жизнеспособности. Рекомбинантные клетки Escherichia coli, экспрессирующие люциферазу, использованы нами изучения влияния колистина - полипептидного поликатионного антибиотика полимиксинового ряда. Повреждение клеточной мембраны приводит к пропорциональному увеличению активности внеклеточной люциферазы (Aex). Остаточная концентрация живых клеток пропорциональна активности фермента внутри клетки (Аin). Для изучения эффективности действия мембрано-активных сапонинов (дигитонина и его аналогов диосцина и протодиосцина) мы разработали тест-систему для непрерывной регистрации процесса пермеабилизации клеточной мембраны в режиме реального времени на основе клеток НЕК293, экспрессирующих люциферазу, по накоплению люциферазной активности (Aex). Показали, что литическая активность сапонинов зависит не только от концентрации агента и длительности инкубации, но и от его структуры - дигитонин, проявляет высокую литическую активность за счет образования комплексов с холестерином, что приводит к образованию пор. Однако, незначительные изменения структуры у его аналогов - уменьшение числа углеводных циклов в молекуле диосцина или наличие объемного заместителя в агликоновой части молекулы протодиосцина приводит к резкому снижению их литической активности. Таким образом, разработанные тест-системы на основе живых клеток могут быть использованы для скрининга лекарственных средств и изучения механизма их действия.

Люцифераза светляков как маркер в биолюминесцентном иммуноанализе. Мы разработали универсальный метод получения высокоактивных, стабильных и функционально активных конъюгатов термостабильной люциферазы с биоспецифичными белками (альбумином, авидином из куриных яиц и антителами) и продемонстрировали возможности их использования в различных схемах иммуноферментного анализа. Для этого к поверхностным SH-группам остатков цистеина люциферазы присоединяли целевые белки с использованием гетеробифункционального сшивающего агента - N-сукцинимидил -3-(2-пиридилдитио)-пропионата (SPDP), специфичного к SH-группам люциферазы и NH2-группам белка. Наличие спейсера между конъюгированными белками и удаленность точек пришивки от активного центра позволило сохранить подвижность молекул, ферментативную активность и способность к аффинному связыванию. Полученные конъюгаты успешно апробированы в биолюминесцентном иммуноанализе. Так, конъюгат Luc-Alb использовали в конкурентном ИФА для детекции микроальбуминурии, что позволило регистрировать свободный альбумин в анализируемом образце в диапазоне концентраций от 5 до 300 мкг/мл. Конъюгат Luc-Avi является универсальной аффинной меткой, позволяющий выявлять любые биотинилированные макромолекулы, такие как биотинилированные вторичные антитела. Конъюгаты люциферазы с авидином и антителами использовали для иммуноферментного определения клеток Salmonella с пределом обнаружения клеток 5·104 КОЕ/мл. Для снижения предела обнаружения клеток Salmonella paratyphi A мы получили конъюгаты Luc-AntiSal и разработали псевдо-гомогенный биолюминесцентный иммуноферментный анализ бактериальных клеток с использованием новой матрицы для захвата аналита - микрочастиц полистирола, покрытых Pluronic F108-PDS, ковалентно меченных антителами Sal. Использование этой матрицы позволило эффективно улавливать анализируемые клетки сальмонеллы в растворе и их детектировать с пределом обнаружения 2,7 x 103 КОЕ/мл без предварительного концентрирования образца. Этот подход может быть использован для анализа бактериальных клеток в биологических образцах, продуктах питания и других анализируемых объектах.

Firefly luciferase catalyzes the oxidation of D-luciferin by oxygen in the presence of ATP and magnesium ions, which is accompanied by bioluminescence in the region of 450–600 nm. In our laboratory, various mutant forms of the thermal stable firefly luciferase Luciola mingrelica, differing in their bioluminescence spectra, were obtained, which were successfully used as highly sensitive protein markers for studying specific intermolecular interactions in molecular diagnostic methods. The advantage of bioluminescent systems is the absence of a background signal and the ease of detection - they do not require a source of exciting radiation. The use of thermostable luciferase makes it possible to conduct studies at 37°C and above without changing the activity of the enzyme inside and outside cells for a long time, which opens up great opportunities for working with living cells.

Luciferase as a marker of intracellular processes. Test systems based on living prokaryotic and eukaryotic cells producing thermostable firefly luciferase can be used to study any external factors of a physical and chemical nature that affect their functioning. Bioluminescent cells make it possible to register the initial stages of changes in cell membrane permeability and assess the degree of cell damage in the presence of membrane-active compounds, which is one of the criteria for their viability. Recombinant Escherichia coli cells expressing luciferase were used to study the effect of colistin, a polypeptide polycationic antibiotic of the polymyxin series. Damage to the cell membrane leads to a proportional increase in extracellular luciferase (Aex) activity. The residual concentration of living cells is proportional to the activity of the enzyme inside the cell (Ain). To study the effectiveness of the action of membrane-active saponins (digitonin and its analogs dioscin and protodioscin), we developed a test system for continuous recording of the process of cell membrane permeabilization in real time based on HEK293 cells expressing luciferase, based on the accumulation of luciferase activity (Aex). It was shown that the lytic activity of saponins depends not only on the concentration of the agent and the duration of incubation, but also on its structure - digitonin exhibits high lytic activity due to the formation of complexes with cholesterol, which leads to the formation of pores. However, slight changes in the structure of its analogues - a decrease in the number of carbohydrate cycles in the dioscin molecule or the presence of a bulky substituent in the aglycone part of the protodioscin molecule - leads to a sharp decrease in their lytic activity. Thus, the developed test systems based on living cells can be used for screening drugs and studying the mechanism of their action.

Firefly luciferase as a marker in bioluminescent immunoassay. We have developed a universal method for obtaining highly active, stable and functionally active conjugates of thermostable luciferase with biospecific proteins (albumin, avidin from chicken eggs and antibodies) and demonstrated the possibility of their use in various enzyme immunoassay schemes. To do this, target proteins were attached to the surface SH groups of luciferase cysteine residues using a heterobifunctional crosslinking agent, N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate (SPDP), which is specific for luciferase SH- groups and NH2-groups of the protein. The presence of a spacer between the conjugated proteins and the remoteness of the attachment points from the active site made it possible to preserve the mobility of molecules, enzymatic activity, and the ability to bind affinity. The obtained conjugates were successfully tested in bioluminescent immunoassay. Thus, the Luc-Alb conjugate was used in competitive ELISA for the detection of microalbuminuria, which made it possible to detect free albumin in the analyzed sample in the concentration range from 5 to 300 µg/mL. The Luc-Avi conjugate is a versatile affinity tag that can detect any biotinylated macromolecule, such as a biotinylated secondary antibody. Luciferase conjugates with avidin and antibodies were used for enzyme immunoassay detection of Salmonella cells with a cell detection limit of 5 104 CFU/ml. To reduce the detection limit of Salmonella paratyphi A cells, we obtained Luc-AntiSal conjugates and developed a pseudo-homogeneous bioluminescent enzyme immunoassay of bacterial cells using a new matrix for analyte capture - polystyrene microparticles coated with Pluronic F108-PDS, covalently labeled with Sal antibodies. The use of this matrix made it possible to effectively trap the analyzed Salmonella cells in solution and detect them with a detection limit of 2.7 x 103 CFU/ml without prior concentration of the sample. This approach can be used to analyze bacterial cells in biological samples, food and other analyzed objects.