В отличие от сосудов нормальных тканей, сосуды злокачественных новообразований обладают рядом структурных и функциональных аномалий. Они извилистые, мешковидные, их стенки высоко проницаемы благодаря неравномерному покрытию базальной мембраной, эндотелием и перицитами. Такие аномалии способствуют формированию участков гипоксии опухоли, в итоге вызывая снижение чувствительности к лечению. Важно отметить, что различные типы опухолей существенно отличаются друг от друга по структуре сосудов, и эти различия рассматриваются как прогностический критерий и определяют выбор способа терапии. Понимание особенностей и характеристик кровеносного русла новообразования позволит своевременно предсказать ответ опухоли на лечение и скорректировать воздействие на ткань.

В настоящей работе для оценки структуры сосудистого русла и уровня оксигенации экспериментальных новообразований было предложено сочетание методов оптоакустической (ОА) микроскопии и оптической диффузионной спектроскопии (ОДС). Оптоакустическая ангиография - удобный неинвазивный метод визуализации сосудов. Он основан на регистрации ультразвуковых волн, индуцированных расширением участка тканей после поглощения лазерных импульсов молекулами гемоглобина. Метод ОА позволяет визуализировать трехмерное распределение гемоглобина, давая картину расположения кровеносных сосудов тканей. Оценка кислородного статуса возможна с помощью метода оптической диффузионной спектроскопии. ОДС также основан на абсорбционной способности гемоглобина. При этом метод позволяет оценить концентрации и соотношение окси- и дезокси- формы данного соединения, характеризующих баланс доставки кислорода к тканям и его потребления. Целью работы было сравнение структуры сосудов и уровня оксигенации экспериментальных опухолей различного морфогенеза методами ОА и ОДС. Для верификации данных ОДС проводилось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование опухолевых тканей с маркером гипоксии пимонидазолом (ПМ).

Исследование было проведено на мышах самках линии Balb/c-nude с привитыми подкожно опухолями. Для эксперимента были выбраны три опухолевые модели на основе клеточных линий SN-12C (рак почки человека, n = 4), HCT116 (рак толстого кишечника человека, n = 4), Colo320 (рак толстого кишечника человека, n = 4). Исследование осуществляли при среднем объеме новообразования 700 мм3 на 29 день роста опухолей HCT116 и Colo320, и на 125 день роста SN-12C.

Для ОА и ОДС исследований животные под изофлурановым наркозом закреплялись в положении на боку на переносной опорной пластине, имеющей отверстие для расположения зоны исследования над датчиком ОА микроскопа. Для ОА использована установка (ИПФ РАН) с лазером с длинной волны 532 нм и частотой следования и длительностью импульсов 2 кГц и 1 нс. Для ОДС использована установка (ИПФ РАН) с оптическим зондом из четырех волокон, использующая в качестве источника светодиод с длиной волны 400-700 нм и спектрометр в качестве детектора. Для ИГХ ПМ вводили внутрибрюшинно, через 45 минут опухоли извлекали, изготавливали криосрезы. Срезы окрашивали с использованием мышиных моноклональных антител к пимонидазолу, конъюгированных с флуоресцинизотиоцианатом. Относительную гипоксическую фракцию рассчитывали как процент площади ПМ-положительных зон от общей площади образца.

В ходе работы показано, что опухоли SN-12C характеризуются низкой скоростью роста по сравнению с Colo320 и HCT116, время удвоения объема опухоли данной модели превышает таковое для Colo320 2,5 раз и для HCT116 в 2,3 раза. Методом ОДС у Colo320 показано повышенное содержание гемоглобина и сниженный уровень насыщения крови кислородом по сравнению с SN-12C и HCT116. Причиной сниженной оксигенации является высокое содержание дезоксигемоглобина, характеризующего потребление кислорода тканями. С помощью ОА визуализации показано отсутствие регулярной структуры сосудистой сети всех экспериментальных новообразований. Опухоль Colo320 характеризуется присутствием обширных гемоглобин-содержащих структур, предположительно, кровоизлияний, а также более высокими значениями размера и фракции сосудов. Для HCT116 и SN-12C значения данных показателей были сопоставимы с нормой. Методом ИГХ у Colo320 выявлены более высокие значения относительной гипоксической фракции по сравнению с SN-12C и HCT116, что подтверждает результаты ОДС.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского Научного Фонда № 21-15-00032.

Compared to the vessels of normal tissues, the vessels of malignant neoplasms have a number of structural and functional anomalies. They are tortuous, saccular, and their walls are highly permeable due to the uneven coverage of the basement membrane, endothelium, and pericytes. Such anomalies contribute to the formation of areas of tumor hypoxia, ultimately causing a decrease in sensitivity to treatment. It is important to note that different types of tumors differ significantly from each other in the structure of blood vessels, and these differences are considered as a prognostic criterion and determine the choice of the method of therapy. Understanding the features and characteristics of the bloodstream of the neoplasm will make possible timely predict the tumor response to treatment and correct the effect on the tissue.

In this work, a combination of optoacoustic (OA) microscopy and optical diffuse spectroscopy (DOS) was proposed to assess the structure of the vascular bed and the level of oxygenation of experimental neoplasms. Optoacoustic angiography is a convenient non-invasive method for visualizing blood vessels. It is based on the registration of ultrasonic waves induced by the expansion of a tissue area after the absorption of laser pulses by hemoglobin molecules. The OA method allows you to visualize the three-dimensional distribution of hemoglobin, giving a picture of the location of the blood vessels of tissues. Assessment of the oxygen status is possible using the method of optical diffuse spectroscopy. DOS is also based on the absorption capacity of hemoglobin. At the same time, the method makes it possible to estimate the concentration and ratio of the oxy- and deoxy-forms of a given compound, which characterize the balance of oxygen delivery to tissues and its consumption. The aim of the work was to compare the structure of blood vessels and the level of oxygenation of experimental tumors of different morphogenesis by OA and DOS methods. To verify the DOS data, an immunohistochemistry (IHC) study of tumor tissues with the hypoxia marker pimonidazole (PM) was performed.

The study was carried out on Balb/c-nude female mice with tumors inoculated subcutaneously. Three tumor models based on cell lines SN-12C (human kidney cancer, n = 4), HCT116 (human colon cancer, n = 4), Colo320 (human colon cancer, n = 4) were selected for the experiment. The study was performed at an average neoplasm volume of 700 mm3 on day 29 of growth of HCT116 and Colo320 tumors, and on day 125 of growth of SN-12C.

For OA and DOS studies, animals under isoflurane anesthesia were fixed in a side position on a portable base plate with a hole for positioning the study area above the OA sensor of the microscope. For OA, a setup (IAP RAS) with a laser with a wavelength of 532 nm and a repetition rate and pulse duration of 2 kHz and 1 ns was used. For the ODS, we used an installation (IAP RAS) with an optical probe of four fibers, using a light-emitting diode with a wavelength of 400–700 nm as a source and a spectrometer as a detector. For IHC, PM was injected intraperitoneally, after 45 minutes the tumors were removed, and cryosections were made. Sections were stained with mouse monoclonal antibodies to pimonidazole conjugated with fluorescein isothiocyanate. The relative hypoxic fraction was calculated as the percentage of the area of PM-positive zones of the total area of the sample.

In the course of the work, it was shown that SN-12C tumors are characterized by a low growth rate compared to Colo320 and HCT116, the doubling time of the tumor volume of this model exceeds that for Colo320 by 2.5 times and for HCT116 by 2.3 times. The DOS method in Colo320 showed an increased content of hemoglobin and a reduced level of blood oxygen saturation compared to SN-12C and HCT116. The reason for reduced oxygenation is the high content of deoxyhemoglobin, which characterizes the oxygen consumption of tissues. Using OA imaging, the absence of a regular structure of the vasculature of all experimental neoplasms was shown. The Colo320 tumor is characterized by the presence of extensive hemoglobin-containing structures, presumably hemorrhages, as well as higher values of vessel size and fraction. For HCT116 and SN-12C, the values of these indicators were comparable to the norm. The IHC method revealed higher values of the relative hypoxic fraction in Colo320 compared to SN-12C and HCT116, which confirms the results of the DOS.

The work was supported by the grant of the Russian Science Foundation No. 21-15-00032.