Известно, что в хлоропластах высших растений пероксид водорода (Н2О2) образуется в реакции диспропорционирования супероксидных анион-радикалов (O2•−), катализируемой супероксиддисмутазой (СОД) в строме хлоропластов (Asada, 1999). Нами показано, что часть молекул Н2О2 образуется в тилакоидных мембранах хлоропластов, и что при увеличении интенсивности действующего света рост образования Н2О2 происходит, в основном, за счет образования в мембране. В мембране отсутствует СОД, кроме того, реакция диспропорционирования O2•− в апротонной среде мембраны с низкой диэлектрической проницаемостью затруднена, предполагая протекание другого, отличного от диспропорционирования, пути образования Н2О2 в тилакоидной мембране. Нами установлено, что образование «мембранного» Н2О2 происходит в результате реакции O2•− с пластогидрохиноном (ПХН2): ПХH2 + O2•− → ПХ•− + Н2О2; реакция является термодинамически выгодной вследствие большой разницы между величинами окислительно-восстановительных потенциалов пар ПХ•−/ ПХH2 (Em7 370 мВ) (Hauska и др., 1983) и O2•−/Н2О2 (Em7 940 мВ) (Asada, 1999); расчетная константа термодинамического равновесия реакции ~ 5×10^9 (Mubarakshina, Ivanov, 2010). Согласно этим потенциалам, реакция ПХH2 + O2•− протекает на границе фаз тилакоидная мембрана/строма.

Н2О2 – одна из наиболее важных сигнальных молекул среди активных форм кислорода (АФК). Основополагающим фактором осуществления ретроградного сигнала (сигнала от органелл к ядру) является способность АФК диффундировать от места образования до места передачи сигнала. Нами были исследованы а) возможность диффузии Н2О2 через мембраны оболочки хлоропласта и б) механизм этой диффузии с помощью метода ЭПР с применением гидрофильной спиновой ловушки POBN, а также с помощью конфокальной микроскопии и красителя Amplex Red. Полученные результаты показали, что даже при низкой интенсивности света часть молекул Н2О2, образующихся внутри хлоропластов, способны диффундировать через мембраны хлоропластов.

Для выяснения механизма диффузии Н2О2 была исследована роль аквапоринов – белков, формирующих поры в хлоропластной мембране, через которые проходят молекулы воды. Используя ингибиторы аквапоринов AgNO3 и ацетазоламид (AZA), было показано, что Н2О2 диффундирует через оболочку хлоропласта через аквапорины. В экспериментах с использованием AZA, который помимо ингибирования аквапоринов, известен также как ингибитор карбоангидраз (КА), ферментов, катализирующих обратимую реакцию образования угольной кислоты из диоксида углерода и воды, было обнаружено, что оболочка хлоропласта обладает КА активностью, что указывает на наличие КА, связанной(ых) с оболочкой хлоропласта.

Учитывая, что произвольная диффузия молекул Н2О2 через мембраны маловероятна, коэффициент распределения гидрофобная фаза (бензол)/вода 0.005 (Leo и др., 1971), участие аквапоринов в транспорте Н2О2 через оболочку хлоропластов позволяет рассматривать эти белки как важный элемент внутриклеточной сигнализации. Полученные нами данные о наличии КА, связанной(ых) с оболочкой хлоропласта, свидетельствуют о том, что регуляция активности аквапоринов, связана, по-видимому, с функционированием карбоангидраз мембранной оболочки хлоропластов.

It is known that in the chloroplasts of higher plants hydrogen peroxide (H2O2) is formed in the superoxide anion-radical disproportionation reaction (O2•−) catalyzed by superoxide dismutase (SOD) in the chloroplast stroma (Asada, 1999). We have shown that part of H2O2 molecules is formed in the thylakoid membranes of chloroplasts and that the increase of H2O2 formation with increasing light intensity occurs mainly due to the formation in the membrane. There is no SOD in the membrane; moreover, the disproportionation reaction of O2•− in the aprotonic medium of the membrane with low dielectric permittivity is hampered, suggesting that another, different from disproportionation, pathway of H2O2 formation in the thylakoid membrane is taking place. We found that the formation of the "membrane" H2O2 occurs as a result of the reaction of O2•− with plastohydroquinone (PQH2): PQH2 + O2•− → PQ•− + H2O2; the reaction is thermodynamically favorable because of the large difference between the values of the redox potentials of the PQ•−/PQH2 (Em7 370 mV) (Hauska et al., 1983) and O2•−/ H2O2 (Em7 940 mV) pairs (Asada, 1999); the calculated thermodynamic equilibrium constant of the reaction ~ 5×10^9 (Mubarakshina, Ivanov, 2010) According to these potentials, the reaction of PQH2 with O2•− proceeds at the thylakoid membrane/stroma phase boundary.

H2O2 is one of the most important signaling molecules among reactive oxygen species (ROS). A fundamental factor for the implementation of retrograde signal by ROS (signal from organelles to the nucleus) is the ability of ROS to diffuse from the site of formation to the site of signal induction. We investigated i) the possibility of H2O2 to diffuse through chloroplast envelope membranes and ii) the mechanism of this diffusion using the EPR method and hydrophilic spin trap POBN, as well as confocal microscopy and Amplex Red dye. The results showed that some of the H2O2 molecules formed inside the chloroplasts are able to diffuse through the chloroplast membranes even at low light intensities.

To elucidate the mechanism of H2O2 diffusion, the role of aquaporins, proteins that form pores in the chloroplast membrane, was investigated. Using the aquaporin inhibitors AgNO3 and acetazolamide (AZA), it was shown that H2O2 diffuses through the chloroplast membrane via aquaporins. In experiments with AZA, which in addition to inhibiting aquaporins is also known as a carboanhydrase (CA) inhibitor, enzymes that catalyze the reversible reaction of carbonic acid formation from carbon dioxide and water, the chloroplast envelope was found to have CA activity, indicating the presence of CA(s) bound to the chloroplast envelope.

Considering that passive diffusion of H2O2 molecules through membranes is unlikely, the hydrophobic phase (benzene)/water distribution coefficient being 0.005 (Leo et al., 1971), the participation of aquaporins in the transport of H2O2 through the chloroplast envelope allows us to consider these proteins as an important element of intracellular signaling. The data we obtained on the presence of CA(s) bound to the chloroplast envelope indicate that the regulation of aquaporin activity appears to be related to the functioning of chloroplast membrane envelope CA(s).