Хлорофилл-связывающие белки семейства WSCP (Water Soluble Chlorophyll-binding Proteins) высших растений, в отличие от мембранных пигмент-белковых ансамблей фотосинтетического аппарата, являются водорастворимыми комплексами; они локализованы вне мембранных структур хлоропластов и не участвуют в фотосинтезе. Холоформы WSCP имеют тетрамерную структуру и связывают до четырех молекул хлорофиллов (Хл) [1].

Молекулы Хл в холоформах WSCP уложены в виде молекулярных димеров - аналогов «специальной пары» хлорофиллов (бактериохлорофиллов) в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ), то есть существует конвергентное сходство между WSCP и РЦ. Поскольку «специальная пара» Хл (БХл) в РЦ играет роль донора электрона в первичном фотохимическом акте, возникает вопрос о способности димеров Хл в составе WSCP проявлять фотохимическую активность. Несмотря на обнаруженную ранее фотогенерацию молекулами Хл в WSCP возбужденного триплетного состояния [2], способность WSCP фотоиндуцировать реакции переноса электрона изучена не была.

Для выяснения возможности участия Хл в составе WSCP в фотохимических процессах мы исследовали взаимодействие собранных in vitro холоформ WSCP с акцепторами и донорами электрона при облучении их растворов красным светом, поглощаемым только Хл. В качестве объектов были выбраны белки BoWSCP и LvWSCP - представители подклассов семейства WSCP IIa (связывают только Хл a) и IIb (связывают, помимо Хл a, до 30% Хл b), соответственно.

Облучение BoWSCP в присутствии цитохрома c красным светом (λ≥650 нм) в деаэрированной среде приводило к восстановлению цитохрома, детектируемому по приросту его пика поглощения при 550 нм. Константа скорости фотовосстановления цитохрома c линейно зависела от концентрации цитохрома, что свидетельствует о прямом взаимодействии цитохрома с фотовозбужденным димером Хл в WSCP. Установлено, что источником электрона для восстановления цитохрома в наших экспериментах служил Трис (трис(гидроксиметил)аминометан), присутствовавший в пробах в качестве буферного основания [3].

При облучении красным светом насыщенных воздухом растворов WSCP наблюдалось эффективное окисление доноров электрона - НАДН или аскорбата. В бескислородной среде фотоокисление доноров не происходило. Снижение скорости фотоокисления доноров при добавлении NaN3 – тушителя триплетного состояния Хл и синглетного кислорода (1О2) - указывало на протекание реакции по механизму типа II, то есть через фотосенсибилизированную Хл генерацию 1О2. Константа скорости фотоокисления НАДН заметно не отличалась для BoWSCP и LvWSCP, что согласуется с близкими значениями квантового выхода генерации синглетного кислорода Хл a и Хл b.

В процессе фотоокисления НАДН и аскорбата интенсивность полосы поглощения Хл, а также амплитуда сигнала кругового дихроизма, соответствующего димерам Хл, падали незначительно (до 10% за 15 мин экспозиции). Это указывает на значительную устойчивость как самого Хл в WSCP, так и его димерной структуры к активным формам кислорода. Константа скорости фотоиндуцированного BoWSCP окисления аскорбата была выше, чем НАДН, хотя последний является более сильным восстановителем. Это, очевидно, связано с разной эффективностью взаимодействия доноров электрона с синглетным кислородом: константа тушения 1О2 аскорбатом (kq = 4х108) вдвое превышает её значение для NADH (kq = 2х108).

Обнаруженная фотосенсибилизирующая активность димера Хл в составе холобелков WSCP открывает перспективу для установления механизмов фотопротекторной функции белков этого семейства в растительной клетке. Выявление фотохимической редокс-активности у димеров Хл в WSCP является предпосылкой для конструирования на основе этих белков водорастворимых моделей реакционных центров фотосинтетических систем с целью исследования эволюции фотосинтетического аппарата, а также разработки нового поколения нанобиосенсоров, искусственных конверторов солнечной энергии и фототерапевтических препаратов.



Работа поддержана фондом РНФ (грант № 21-74-20155).



1. Малеева Ю.В., Неверов К.В., Обухов Ю.Н., Крицкий М.С. Водорастворимые хлорофилл-связывающие белки растений: структура, свойства и функции // Молекулярная биология. 2019, №6: Т. 53. - стр. 998-1011.

2. Agostini A., Palm D.M., Schmitt F.-J., Albertini M., Valentin M.D., Paulsen H., Carbonera D. An unusual role for the phytyl chains in the photoprotection of the chlorophylls bound to Water-Soluble Chlorophyll-binding Proteins // Scientific Reports. 2017, V.7, P.7504.

3. Обухов Ю.Н., Неверов К.В., Малеева Ю.В., Крицкий М.С. Димеры хлорофилла a в составе водорастворимого белка BoWSCP фотосенсибилизируют восстановление цитохрома с // Доклады РАН.Науки о жизни. 2023. Т. 509(1). С. 88–92.

Water Soluble Chlorophyll-binding Proteins (WSCP) of higher plants, in contrast to the membrane bound pigment-protein ensembles of the photosynthetic apparatus, are water-soluble complexes that are localized outside the chloroplast membranes and do not take part in photosynthesis. They have a tetrameric structure and bind up to four molecules of chlorophyll (Chl) [1].

Chl molecules in WSCP holoforms are packed as molecular dimers, analogues of the “special pair” of chlorophylls (bacteriochlorophylls) in photosynthetic reaction centers (RCs), i.e., there is a convergent similarity between WSCPs and RCs. Since the “special pair” of Chl (BChl) in RC serves as an electron donor in the primary photochemical event, the question arises about the ability of Chl dimers in WSCPs to exhibit photochemical activity. Despite the described photogeneration of the excited triplet state by Chl molecules in WSCP [2], the ability of WSCP to photoinduce electron transfer reactions has not been studied yet.

To elucidate whether Chl in WSCP could contribute to photochemical processes, we studied the interaction of the in vitro assembled WSCP holoforms with electron acceptors and donors upon irradiation of their solutions with red light that could be absorbed only by Chl. For these purposes, proteins BoWSCP and LvWSCP were selected. These proteins represent the subclasses of the WSCP IIa family (bind only Chl a) and IIb (bind, in addition to Chl a, up to 30% of Chl b), respectively.

Irradiation of BoWSCP in the presence of cytochrome c with red light (λ≥650 nm) in a deaerated solutions led to cytochrome c reduction, which was detected by an increase in its absorption peak at 550 nm. The cytochrome c photoreduction rate constant depended linearly on the cytochrome concentration, which indicates a direct interaction of cytochrome c with the photoexcited Chl dimer in WSCP. Present in the samples as a buffer base Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane) was found to serve as the electron source for cytochrome reduction in our experiments [3].

In air-saturated WSCP solutions irradiated with red light, oxidation of electron donors, NADH or ascorbate, was observed, while in an oxygen-free environment, photooxidation of these donors did not occur. A decrease in the rate of donor photooxidation upon the addition of NaN3, a quencher of the Chl triplet state and inhibitor of singlet oxygen (1O2) generation, indicated that the reaction proceeded according to a type II mechanism, i.e., through the Chl-mediated 1O2 photogeneration. The rate constant of NADH photooxidation did not noticeably differ for BoWSCP and LvWSCP, which is consistent with the similar quantum yields of singlet oxygen generation for Chl a and Chl b.

During the photooxidation of NADH and ascorbate, the amplitude of the Chl absorption band, as well as the amplitude of the circular dichroism signal corresponding to Chl dimers, decreased insignificantly (up to 10% in 15 min of exposure). This indicates a significant resistance of both Chl itself in WSCP and its dimeric structure to reactive oxygen species. The rate constant of BoWSCP-driven photooxidation of ascorbate was higher than that of NADH, although the latter is a stronger reducing agent. This is obviously due to the different efficiency of the interaction of electron donors with singlet oxygen: the 1O2 quenching constant by ascorbate (kq = 4x108) is twice as high as its value for NADH (kq = 2x108).

The discovered photosensitizing activity of the Chl dimer in the WSCP holoproteins sheds light on establishing the mechanisms of the photoprotective function of the proteins of this family in the plant cell. The detection of the photochemical redox activity in Chl dimers in WSCP may serve a prerequisite for constructing water-soluble models of reaction centers of photosynthetic systems in order to study the evolution of the photosynthetic apparatus, as well as to develop a new nanobiosensors, artificial solar energy converters, and phototherapeutic medicines.



This work was supported by the Russian Science Foundation (grant no. 21-74-20155).



1. Maleeva Y.V., Neverov K.V., Obukhov Yu.N., Kritsky M.S. Water Soluble Chlorophyll-binding Proteins in plants: structure, properties and functions // Molecular Biology. 2019. V.53. №6. P.876-888.

2. Agostini A., Palm D.M., Schmitt F.-J., Albertini M., Valentin M.D., Paulsen H., Carbonera D. An unusual role for the phytyl chains in the photoprotection of the chlorophylls bound to Water-Soluble Chlorophyll-binding Proteins // Scientific Reports. 2017, V.7, P.7504.

3. Obukhov Yu.N., Neverov K.V., Maleeva Y.V., Kritsky M.S. Chlorophyll dimmers harbored by water-soluble Protein BoWSCP photosensitize reduction of cytochrome c // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2023. V.509, P. 88-92.