Микробный родопсин почвенной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR) осуществляет светозависимый активный перенос протонов из клетки во внешнюю среду, тем самым преобразуя энергию света в электрохимический потенциал. В основе работы этого белка, как и других микробных родопсинов и родопсинов животных, лежит фотохимическая реакция изомеризации хромофорной группы ретиналя, протекающая в возбужденном состоянии в фемтосекундном диапазоне времени. Ранее нами было показано, что в пикосекундном диапазоне времени существует дополнительный нереакционный путь распада возбужденного состояния, который влияет на общий квантовый выход реакции [1]. Вероятно, наличие нереакционного пути связано с гетерогенностью начального состояния, которая сильно зависит от рН, что было продемонстрировано для близкородственного ESR протонного насоса протеородопсина (PR) [2], протонного насоса бактериородопсина (BR) [3] и натриевого насоса KR2 [4]. Для проверки этой гипотезы была изучена зависимость скорости и эффективности фотореакции ESR от рН.

Работа проведена методом фемтосекундной абсорбционной лазерной спектроскопии при возбуждении ESR импульсами длительностью 25-45 фс и зондировании в диапазоне 400-900 нм. ESR был экспрессирован в E. coli, очищен хроматографически и экстрагирован в 0,05-0,1% DDM при рН 5,3, 7,4 и 9,5. Времена наблюдаемых процессов были оценены путем построения модельных экспоненциальных кривых на основе экспериментальных кинетически кривых.

Было показано, что при каждом выбранном значении рН наблюдаются сигналы из возбужденного состояния, которые сменяются сигналами поглощения первых фотопродуктов, содержащих изомеризованный ретиналь, J и K. Продукт J образуется в фемтосекундном диапазоне времени и за несколько пикосекунд переходит в следующий продукт K. Динамика распада возбужденного состояния ESR состоит из двух компонент – быстрой фемтосекундной, характеризующей реакционный путь образования продукта J, и медленной пикосекундной, характеризующей нереакционный путь возвращения части возбужденных молекул в исходное состояние. При увеличении рН от 5,3 до 9,5 единиц наблюдается уменьшение быстрой компоненты от 830 до 490 фс, что свидетельствует об увеличении скорости фотореакции изомеризации хромофорной группы ретиналя. При этом вклад нереакционного возбужденного состояния уменьшается от 40 до 26%, а квантовый выход фотореакции значительно увеличивается, что видно по увеличению интенсивности сигнала фотопродукта K в 2,5 раза.

Полученные результаты свидетельствуют о значительном влиянии рН на скорость и эффективность фотореакции ESR. В работах [2-4] на примере других микробных родопсинов было показано, что гетерогенность начального состояния связана со степенью протонирования противоиона Шиффова основания (ШО) ретиналя, аминокислотного остатка аспартата, взаимодействие с которым в депротонированной форме сильно влияет на систему электронных уровней ретиналя и динамику фотореакции. В случае ESR это D85, который связан с протоном ШО сильной водородной связью через молекулу воды. При рН 9,5 он полностью депротонирован, что приводит к наиболее быстрой и эффективной фотореакции. Таким образом, можно заключить, что первичные реакции ESR имеют много общего с микробными родопсинами, выполняющими функции катионных насосов. Вероятно, эти свойства связаны с адаптацией родопсинов к условиям окружающей среды, рН которой сдвинут преимущественно в щелочную область, как, например, в море (PR, KR2) и соленых озерах (BR).

Список литературы:

1. Smitienko O.A. et al. // J. Phys. Chem. B. 2021. 125. 995–1008.

2. Chang, C.-F. et al. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019. 21. 25728-25734.

3. Chang, C.-F. et al. // Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202111930.

4. Tahara S. et al. // J. Phys. Chem. B. 2018. 122:18. 4784-4792.

The microbial rhodopsin of the soil bacterium Exiguobacterium sibiricum (ESR) carries out a light-dependent active proton transport from the cell to the external environment, thereby converting light energy into membrane electrochemical potential. The functioning of this protein, as well as other microbial and animal rhodopsins, is based on the photoisomerization of the retinal chromophore group, which proceeds in an excited state in the femtosecond time range. Previously, we have shown that there is an additional non-reactive path of the excited state decay in the picosecond time range, which affects the overall quantum yield of the reaction [1]. It is likely that the presence of the non-reactive pathway is due to the pH-dependent heterogeneity of the initial state, which was demonstrated for the closely related to ESR proton pump proteorhodopsin [2], the proton pump bacteriorhodopsin [3], and the sodium pump KR2 [4]. To test this hypothesis, the dependence of the rate and efficiency of the ESR photoreaction on pH was studied.

The work was carried out by femtosecond laser absorption spectroscopy with 25–45 fs pump pulses and probing in the range of 400–900 nm. ESR was expressed in E. coli, purified by chromatography and extracted into 0.05-0.1% DDM at pH 5.3, 7.4 and 9.5. The characteristic times of the observed processes were estimated by model exponential curves based on experimental kinetic curves.

It was shown that, at each chosen pH value, signals from the excited state are observed, which are replaced by absorption signals of the first photoproducts containing isomerized retinal, J and K. Product J is formed in the femtosecond time range and passes into the next product K in several picoseconds. The dynamics of the excited state decay consists of two components: a fast femtosecond component characterizing the reactive pathway for the formation of product J, and a slow picosecond component characterizing the nonreactive pathway of returning some of the excited molecules to the initial state. With an increase in pH from 5.3 to 9.5 units, a decrease in the fast component from 830 to 490 fs is observed, which indicates an increase in the rate of the photoisomerization of the retinal chromophore group. In this case, the contribution of the non-reactive excited state decreases from 40 to 26%, and the quantum yield of the photoreaction increases significantly, as can be seen from the increase in the signal intensity of the photoproduct K by 2.5 times.

The results obtained indicate a significant effect of pH on the rate and efficiency of the ESR photoreaction. Using other microbial rhodopsins as an example, it was shown in [2–4] that the heterogeneity of the initial state is associated with the degree of protonation of the aspartate amino acid residue, which serves as a counterion to the retinal Schiff base (SB). The interaction with the counterion in the deprotonated form strongly affects the system of electronic levels of retinal and the dynamics of the photoreaction. In the case of ESR, this is D85, which is bound to the proton of SB by a strong hydrogen bond through a water molecule. At pH 9.5, it is completely deprotonated, resulting in the fastest and most efficient photoreaction. Thus, it can be concluded, that the photoreaction of ESR have much in common with microbial rhodopsins that act as cation pumps. Probably, these properties are associated with the adaptation of rhodopsins to environmental conditions, the pH of which is shifted mainly to the alkaline region, such as, for example, in the sea (PR, KR2) and salt lakes (BR).

Bibliography:

1. Smitienko O.A. et al. // J. Phys. Chem. B. 2021. 125. 995–1008.

2. Chang, C.-F. et al. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019. 21. 25728-25734.

3. Chang, C.-F. et al. // Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202111930.

4. Tahara S. et al. // J. Phys. Chem. B. 2018. 122:18. 4784-4792.