Направленный синтез новых перспективных для фотодинамической терапии фотосенсибилизаторов (ФС) требует разработки новых подходов к оценке их эффективности и определения влияющих на неё структурных факторов. Эффективность большинства ФС определяется в исследованиях либо на клеточных культурах, либо в растворах, что не позволяет получить количественную информацию об адсорбционных и фотодинамических свойствах ФС на мембране. Существует ряд работ, посвященных исследованию этих свойств на системах, моделирующих клеточную мембрану, которые в основном различаются выбором мишени синглетного кислорода (МСК) и способом регистрации её окисления.

Нами была разработана оригинальная методика для оценки фотодинамической активности ФС на бислойной липидной мембране (БЛМ) [1,2]. Она основана на измерении межфазных скачков потенциалов, возникающих при адсорбции, десорбции и/или разрушении исследуемых молекул, тремя различными методами. Сравнение полученных результатов позволяет определить, способны ли молекулы ФС проникать через мембрану, на какой глубине расположены их заряженные группы, а также оценить поверхностную плотность молекул в мембране. Фотодинамическую активность ФС, как и в других исследованиях, оценивают по скорости разрушения введенной в мембрану молекул МСК, адсорбция и разрушение которых регистрируется по изменению граничного потенциала. Применение этой методики для изучения коммерчески доступных сульфированных комплексов фталоцианина с алюминием [1] и четырежды сульфированного свободного порфирина [2], позволило установить, что фотодинамическая эффективность в значительной степени определяется адсорбцией ФС на мембране и глубиной их погружения в гидрофобную область мембраны.

Данная работа является продолжением упомянутых выше и посвящена изучению влияния структурных факторов ФС на их адсорбцию и фотодинамическую эффективность. В работе были изучены две схожие по структуре серии ФС, синтезированные в ИФХЭ РАН:

1. Комплексы порфирина с фосфором (V), различающиеся числом пиридиновых заместителей на периферии (0,1 или 2) и структурой аксиального лиганда: гидроксильный (OH) или этоксильный (OEt);

2. Окта-катионные замещенные фталоцианины (свободный лиганд, комплексы с цинком (8bZnPc) и магнием (8bMgPc)), структура которых представлена в [3].

Адсорбция всех исследованных соединений приводит к изменению межфазных скачков потенциала, за исключением незамещенных порфиринов (не имеющих пиридиновых заместителей). Сравнение полученных данных показало, что все исследованные соединения адсорбируются на БЛМ с погружением заряженных заместителей в область фосфолипидных головок.

В случае порфиринов установлено, что структура аксиального лиганда наиболее сильно влияет на их положение в БЛМ, при этом не влияя на их сродство с мембраной. Порфирины с гидроксильными аксиальными лигандами P(OH)2 способны проходить через мембрану, в отличие от порфиринов с этоксильными P(OEt)2. Изменение граничного потенциала при адсорбции порфиринов P(OEt)2 по величине было больше, чем у P(OH)2. Данный факт, вероятнее всего, связан с различной ориентацией и положением в мембране порфиринов, имеющих разные аксиальные лиганды, что и объясняет способность проникать через мембрану только P(OH)2.

Потенциал адсорбции Фц почти не зависит от структуры иона в центре макрокольца Фц. Фц не способны проникать через мембрану. Адсорбция Фц на поверхности мембраны также регистрируется по их флуоресценции на липосомах. В буферном растворе эти соединения практически не флуоресцируют, поскольку существуют в виде агрегатов. Добавление липосом инициирует мономеризацию Фц с полным восстановлением флуоресцентных свойств. Полученные зависимости позволяют оценить константы ассоциации этих ФС с липидами DPhPC, которые составляют 4*10^3 М-1, 5,5*10^3 М^-1 для 8bZnPc и 8bMgPc соответственно.

Фотодинамическая активность ФС, которую определяли по скорости разрушения МСК, наблюдается со всеми соединениями, включая порфирины, адсорбция которых не наблюдается по изменению потенциала. Данный факт свидетельствует о том, что незамещенные порфирины также адсорбируются на БЛМ. Для порфиринов свойственна возрастающая линейная зависимость скорости разрушения MCK от концентрации ФС, причем P(OEt)2 обладают большей фотодинамической активностью, чем P(OН)2. Вероятнее всего, данное различие связано с различным положением ФС в БЛМ. С другой стороны, увеличение количества пиридиновых заместителей порфирина приводит к усилению его фотодеградации, что приводит к уменьшению эффективности.

Концентрационная зависимость активности для Фц имеет более сложный характер: скорость разрушения МСК линейно возрастает при низких концентрациях ФС после чего выходит на плато. Данный факт можно объяснить способностью Фц тушить синглетный кислород. Значительного различия в эффективностях Фц, имеющих различные ионы в центре макрокольца, не зафиксировано.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что фотодинамическая активность ФС в значительной степени определяется их положением и эффективностью связывания с мембраной, которая в свою очередь сильно зависит от природы заместителей на периферии макрокольца ФС и аксиального лиганда.

Работа поддержана проектом РНФ № 19-13-00410-P.

1. Sokolov, V. S. et al. Residence time of singlet oxygen in membranes. Sci. Rep. 8, 1–11 (2018).

2. Konstantinova, A. N. et al. Adsorption and photodynamic efficiency of meso-tetrakis(p-sulfonatophenyl)porphyrin on the surface of bilayer lipid membranes. J. Photochem. Photobiol. B Biol. 189, 74–80 (2018).

3. Bunin, D. A., Martynov, A. G., Safonova, E. A., Tsivadze, A. Y. & Gorbunova, Y. G. Robust route toward cationic phthalocyanines through reductive amination. Dye. Pigment. 207, 110768 (2022).

The development of the photodynamic therapy method is associated with the research and directed synthesis of new photosensitizers (PS), as well as the development of methods to evaluate their effectiveness. Currently, the effectiveness of new potential drugs is tested mostly in vitro. Despite the enormous advantages of this testing technique, it does not provide definitive answers to questions about the interactions of the studied photosensitizer with the cell membrane (the first barrier on the way of PS into the cell) or the factors influencing the photodynamic activity of membrane-bound PS.

In earlier research we have developed the original procedure for the estimation of the adsorption and photodynamic activity of PS on bilayer lipid membrane (BLM) [1,2]. It is based upon the measurements of the changes in the membrane/water boundary potentials (BP) by three methods. Comparison of obtained values allowed to define the capability of PS to penetrate membrane, the position of PS charge group in it and to estimate the PS surface density in membrane. The photodynamic activity of membrane-bound PS was estimated by the destruction rate of singlet oxygen target (TO), which was adsorbed on the membrane and its destruction was monitored by measuring the boundary potential change during illumination. This procedure was used to study the commercially available compounds: sulphonated complex of phthalocyanines with aluminum (AlPcSn, n-number of sulphogroup) [1] and meso-tetra-(4-sulfonatophenyl) porphyrin [2]. The main investigation result was a proof of a connection between an increase in PS immersion depth into the membrane results and an increase in PS efficiency and a confirmation of the effect of PS binding to the membrane.

The goal of this research is to determine how PS structural elements affect the position of PS in the membrane and the effectiveness of PS. This work studies two distinct series of similar compounds synthesized in our institute:

1. phosphorus(V) porphyrins with different number of pyridyl peripheral groups (0, 1, 2) and axial ligands (hydroxy or ethoxy)

2. octa-cationic phthalocyanines as free-base, magnesium(II) and zinc(II) complexes (8bMePc, Me=H2, Mg, Zn) [3].

Adsorption of all compounds except porphyrins without pyridyl peripheral groups can be detected by BP change. The results show that independently of the analyzed PS structure, all PS possessing the charged peripheral groups have them immersed into the BLM below the phospholipid polar heads.

The structure of the axial ligand of porphyrins significantly influences their position in the BLM but not the binding affinity to the membrane. Porphyrins with hydroxy ligands P(OH)2 can penetrate the membrane, whereas porphyrins with ethoxy ligands P(OEt)2 cannot. However, the boundary potentials for P(OEt)2 was larger than the ones for P(OH)2. This fact is most likely associated with different orientations and positions of porphyrins with different axial ligands in the BLM, which explains the ability of P(OH)2 to penetrate through the membrane.

The phthalocyanines (Pc) adsorption potential is almost independent on the Pc macrocycle ion structure. Pc are unable to penetrate the membrane as well. The Pc adsorption on the membrane surface was detected by the Pc fluorescence spectra. These compounds aggregate in an aqueous solution, quenching their fluorescence. The introduction of liposomes consisting in DPhPC into the solution initiates the PS monomerization with complete restoration of fluorescent properties. The association constants of these Pc with lipids have been evaluated to be 4*10^3 M^-1, 5.5*10^3 M^-1 for 8bZnPc and 8bMgPc, respectively.

PS photodynamic activity is determined by the rate of the TO destruction and is observed for all compounds even those with adsorption not detected by the BP measurements. This fact indicates that porphyrins without pyridyl peripheral groups also adsorb on the BLM. The efficiency of porphyrins has been found to increase linearly with their concentration in solution. The effectiveness of phosphorus porphyrins with ethoxy axial ligands was higher compared to the hydroxy ones. This difference is most likely associated with different positions of the porphyrins with P(OEt)¬2 and P(OH)¬2 in the BLM. The self-destructions of the phosphorus porphyrins in BLM under illumination was observed, the rate of which increases with the number of pyridyl substituents, thus decreasing their efficiency as PS.

In case of phthalocyanines, the concentration dependencies of activity are more complex: the rate of TO oxidation increases linearly while PS concentrations are low, before it reaches a plateau. These differences in concentration dependence for phthalocyanines can be explained by the well-known ability to quench the singlet oxygen just by phthalocyanines. Furthermore, the significant difference in TO damage due to the influence of the PS macrocycle internal ion wasn’t observed.

These results confirm that the PS efficiency mainly depends on their location and the effectiveness of their binding with BLM which strongly depends on the nature both of the axial ligands as well as the peripheral groups of the macrocycle.

This work was supported by the Russian Science Foundation project no. 19-13-00410-P.

1. Sokolov, V. S. et al. Residence time of singlet oxygen in membranes. Sci. Rep. 8, 1–11 (2018).

2. Sokolov, V. S. et al. Voltage-sensitive styryl dyes as singlet oxygen targets on the surface of bilayer lipid membrane. J. Photochem. Photobiol. B Biol. 161, 162–169 (2016).

3. Bunin, D. A., Martynov, A. G., Safonova, E. A., Tsivadze, A. Y. & Gorbunova, Y. G. Robust route toward cationic phthalocyanines through reductive amination. Dye. Pigment. 207, 110768 (2022).