В тилакоидных мембранах фотосинтетических организмов наряду с суперсемейством хлорофилл-связывающих белков светособирающих комплексов (LHC) и реакционного центра, присутствуют низкомолекулярные светоиндуцируемые белки [1]. Полагают, что эти белки функционируют при фотозащите и сборке тилакоидных пигмент-белковых комплексов, экспрессируются конститутивно и их уровни экспрессии увеличиваются в ответ на стресс и в первую очередь на световой стресс. У мутантов, лишенных этих низкомолекулярных белков фотосинтетический транспорт электронов практически не обнаруживается. В цианобактериях, являющихся эволюционными предшественниками хлоропластов, эти белки называются Hlips (high light-inducible proteins) или SCP (small Cab-like proteins, малые хлорофилл-связывающие белки). Эти белки являются односпиральными мембранными низкомолекулярными и, как полагают, могут связывать хлорофилл, каротиноиды и липидные молекулы и участвовать в сборке фотосистемы I и II [1-2].

Мы полагаем, что такая структурирующая роль SCP/Hlip белков может быть связана с цис-конфигурацией каротиноидов в составе каротиноид-SCP белковых комплексов, присутствующих в тилакоидных мембранах, когда каротиноиды в цис- конфигурации могут являться как бы «склеивающим» началом. С целью выяснения структурирующей роли каротиноидов в фотосинтетическом аппарате разработан метод получения каротиноид-белковых комплексов из тилакоидов цианобактерии Arthrospira planensis (спирулина) с использованием ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы (20-50% водный раствор). Солюбилизированные с помощью детергента n-додецил-β-D-мальтозида (DDM) тилакоиды разделились при ультрацентрифугировании (220000 g, 3 часа, 4oС) на шесть фракций, содержащих хлорофилл-каротиноид-белковые и каротиноид-белковые комплексы. Полученные комплексы были охарактеризованы методами УФ/видимой спектроскопии, кругового дихроизма, ИК колебательной спектроскопии (FTIR), линейного (в т.ч. резонансного) и нелинейного (BCARS) комбинационного рассеяния. Дополнительно, выделенные каротиноид-белковые комплексы подвергали разделению методом электрофореза в ПААГ и разделению в поле поперечного асимметричного потока (AF4) для оценки содержания низкомолекулярных белков. Проведено сопоставление спектров комбинационного рассеяния для каротиноидов в составе комплексов с теоретическими спектрами цис-каротиноидов, полученными методами квантовой химии с помощью нестационарной теории функционала плотности (TD-DFT) и функционала CAM-B3LYP.

В целом, показано наличие в тилакоидных мембранах спирулины каротиноидов в цис-конфигурации в составе каротиноид-белковых и хлорофилл-каротиноид-белковых комплексах, содержащих β-каротин с максимумом поглощения 340 нм и ксантофиллов (миксоксантофилла, осциллаксантина и зеаксантина) с максимумом поглощения в области 383 нм. Методом КД-спектрометрии показано, что в водных условиях солюбилизированные с помощью DDM детергента каротиноид-белковые комплексы склонны к агрегации, вероятно, за счет агрегации каротиноидной составляющей комплекса. При этом фиксируется сильный сигнал КД в области цис-каротиноидов.



Работа была поддержана РНФ (грант №21-74-20155)



1. Beck J, Lohscheider JN, Albert S, Andersson U, Mendgen KW, Rojas-Stütz MC, Adamska I, Funck D. Small One-Helix Proteins Are Essential for Photosynthesis in Arabidopsis.// Front Plant Sci. 2017 Vol. 23:7

2. Rochaix JD, Bassi R. LHC-like proteins involved in stress responses and biogenesis/repair of the photosynthetic apparatus. // Biochem J. 2019 Vol. 476. P. 581

In the thylakoid membranes of photosynthetic organisms, along with the superfamily of chlorophyll-binding proteins of light-harvesting complexes (LHC) and the reaction center, there are low-molecular-weight light-inducible proteins [1]. It is believed that these proteins function in photoprotection and assembly of thylakoid pigment-protein complexes, are expressed constitutively, and their expression levels increase in response to stress and primarily to light stress. In mutants lacking these low molecular weight proteins, photosynthetic electron transport is practically not detected. In cyanobacteria, which are the evolutionary precursors of chloroplasts, these proteins are called Hlips (high light-inducible proteins) or SCPs (small Cab-like proteins, small chlorophyll-binding proteins). These proteins are single stranded membrane low molecular weight proteins and are believed to be able to bind chlorophyll, carotenoids, and lipid molecules and participate in the assembly of photosystem I and II [1-2].

We believe that such a structuring role of SCP/Hlip proteins may be related to the cis-configuration of carotenoids in the carotenoid-SCP protein complexes present in thylakoid membranes, when carotenoids in the cis-configuration are like a "gluing" principle. In order to elucidate the structuring role of carotenoids in the photosynthetic apparatus, a method has been developed for obtaining carotenoid-protein complexes from the thylakoids of the cyanobacterium Arthrospira planensis (spirulina) using ultracentrifugation in a stepwise sucrose gradient (20-50% aqueous solution). Solubilized with the detergent n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), the thylakoids were separated by ultracentrifugation (220,000 g, 3 hours, 4°C) into six fractions containing chlorophyll-carotenoid-protein and carotenoid-protein complexes. The obtained complexes were characterized by UV/visible spectroscopy, circular dichroism, vibrational IR spectroscopy (FTIR), linear (including resonance mode) and nonlinear (BCARS) Raman scattering. Additionally, the isolated carotenoid-protein complexes were separated by electrophoresis in PAAG and separated in the transverse asymmetric flow field (AF4) to assess the content of low molecular weight proteins. The Raman spectra for carotenoids in the composition of complexes were compared with the theoretical spectra of cis-carotenoids obtained by quantum chemistry methods using non-stationary density functional theory (TD-DFT) and the CAM-B3LYP functional.

In general, the presence of cis-configuration carotenoids in the thylakoid membranes of spirulina in the composition of carotenoid-protein and chlorophyll-carotenoid-protein complexes containing β-carotene with an absorption maximum of 340 nm and xanthophylls (mixoxanthophyll, oscillaxanthin and zeaxanthin) with an absorption maximum in the region of 383 nm. CD spectrometry has shown that in aqueous conditions, carotenoid-protein complexes solubilized with DDM detergent are prone to aggregation, probably due to aggregation of the carotenoid component of the complex. At the same time, a strong CD signal is recorded in the cis-carotenoid region.



The research was supported by the Russian Science Foundation grant 21-74-20155



1. Beck J, Lohscheider JN, Albert S, Andersson U, Mendgen KW, Rojas-Stütz MC, Adamska I, Funck D. Small One-Helix Proteins Are Essential for Photosynthesis in Arabidopsis.// Front Plant Sci. 2017 Vol. 23:7

2. Rochaix JD, Bassi R. LHC-like proteins involved in stress responses and biogenesis/repair of the photosynthetic apparatus. // Biochem J. 2019 Vol. 476. P. 581