Введение

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) был впервые выделен из медузы Aequorea Victoria. Он проявляет ярко-зеленую флуоресценцию. Так называемый усиленный GFP (EGFP) представляет собой мутантную версию GFP, с улучшенными спектральными характеристиками, а также более эффективным фолдингом при относительно высоких температурах, что обеспечивает возможность использования EGFP в клетках млекопитающих. Этот белок широко используется в клеточной биологии с применением метода флуоресцентной микроскопии.

Важно изучить влияние различных факторов внешней среды на GFP и его производные, в частности, исследовать стабильность его флуоресцентных свойств и способность восстанавливать флуоресцентный сигнал в процессе денатурации-ренатурации. Ранее [1], исследователям удавалось достичь ренатурации 90% белка GFP. В данной работе мы провели исследование денатурации-ренатурации наиболее часто используемой сегодня версии этого белка – EGFP, а также влияния на его флуоресценцию добавления наночастиц.

Материалы и методы

Спектр флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре JASCO FP-8300 с разрешением 1 нм в кювете с оптическим путем 1 мм. Диапазон измерений составлял: для возбуждения (Ex) – 240-540 нм, для излучения (Em) – 260-600 нм. Итоговый объем всех измеряемых образцов был равен 1.5 мл. Денатурация белка EGFP проводилась в течение 30 мин в 6 M растворе гуанидина HCl (GdHCl). К EGFP добавляли частицы оксида железа (FeO, Fe2O3, Fe3O4), покрытые цитратом натрия (TSC-IONP). Наночастицы были получены путем химического осаждения оксида гидратом аммония из водного раствора смеси солей хлоридов железа. Наночастицы образуют самоорганизующиеся стабильные кластеры размером ~10 и 50–80 нм, состоящие из НЧ размером 3 нм. Стабильность контролировали с помощью метода динамического светорассеяния.

Результаты

Были записаны спектры флуоресценции нативного EGFP. Помимо основного пика флуоресценции Ex488nm/Em510nm (основной пик) наблюдался пик Ex277nm/Em511nm (минорный пик), наличие которого было объяснено существованием двух различных конформаций этого белка ранее [2]. Также присутствовал пик, обусловленный ароматическими остатками, с характерной длиной волны возбуждения в районе 280 нм. При денатурации наблюдалось полное тушение основного и минорного пиков флуоресценции. При этом пик, обусловленный ароматическими остатками, становился более интенсивным (примерно в 2 раза). Это может быть связано с выходом гидрофобных остатков на поверхность белка при его денатурации.

Чтобы пронаблюдать ход денатурации во времени, мы измерили кинетику флуоресценции этого процесса. Нам удалось наблюдать тушение флуоресценции во времени при денатурации EGFP в концентрации 0.053 г/л: интенсивность основного максимума падала в 2 раза менее чем за полминуты. Мы также установили, что при росте концентрации белка тушение флуоресценции при его денатурации замедляется. Так, при концентрации 0.067 г/л уменьшение интенсивности основного максимума в 2 раза происходило уже примерно за 0.8 мин. Вероятно, это связано с уменьшением отношения (число молекул GdHCl)/(число молекул белка) при росте концентрации белка.

Мы также провели исследование восстановления флуоресценции EGFP, подвергнутого денатурации, при ренатурации этого белка путем разбавления (водой) его раствора в GdHCl в 10 и в 50 раз. В первом случае восстановления сигнала флуоресценции не произошло, тогда как при разбавлении в 50 раз (при этом, конечная концентрация EGFP - 0.002 г/л) мы обнаружили восстановление интенсивности флуоресценции в размере 40% от первоначального сигнала. Исходя из предположения о линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации белка, это число можно рассматривать как процент ренатурации.

Дополнительно, было исследовано влияние на спектры флуоресценции добавления различного количества TSC-IONP (концентрации 10 нм кластеров ~10^13-10^14 мл^-1). В данном случае рассматривалось только изменение положения максимума флуоресценции, так как изменение интенсивности флуоресценции было обусловлено, в первую очередь, уменьшением светопропускания раствора наночастиц при увеличении их концентрации. Было обнаружено, что при добавлении TSC-IONP происходит дрейф основного максимума флуоресценции белка в сторону больших длин волн. Это может быть связано с изменением окружения, с которым хромофор белка электростатически взаимодействует. Известно [3], что рядом с хромофором находится ряд полярных групп и структурированных молекул воды. Возможно, частицы, посредством взаимодействия с внешней поверхностью белка, изменяют это окружение хромофора.

Выводы

Таким образом, нам удалось продемонстрировать частичную ренатурацию EGFP и выяснить некоторые детали процесса денатурации-ренатурации. Мы также обнаружили сдвиг основного максимума флуоресценции белка в сторону больших длин волн при добавлении наночастиц оксида железа.

Список источников

1. Ward WW, Bokman SH. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 1982 Sep 14;21(19):4535-40. doi: 10.1021/bi00262a003.

2. Dos Santos NV, Saponi CF, Greaves TL, Pereira JFB. Revealing a new fluorescence peak of the enhanced green fluorescent protein using three-dimensional fluorescence spectroscopy. RSC Adv. 2019 Jul 24;9(40):22853-22858. doi: 10.1039/c9ra02567g.

3. Tsien RY. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509-44. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Introduction

Green fluorescent protein (GFP) was first isolated from the jellyfish Aequorea Victoria. It exhibits bright green fluorescence. The so-called enhanced GFP (EGFP) is a mutant version of GFP, with improved spectral characteristics, as well as more efficient folding at relatively high temperatures, which makes it possible to use EGFP in mammalian cells. This protein is widely used in cell biology through the method of fluorescence microscopy.

It is important to study the influence of various environmental factors on GFP and its derivatives, in particular, to study the stability of its fluorescent properties and the ability to restore the fluorescent signal during denaturation-renaturation. Previously [1], researchers were able to achieve renaturation of 90% of the GFP protein. In this work, we studied the denaturation-renaturation of the most commonly used version of this protein, EGFP, as well as the effect of the addition of nanoparticles on its fluorescence.

Materials and methods

The fluorescence spectrum was recorded using a JASCO spectrofluorimeter FP-8300 with a resolution of 1 nm in the cell with optical path of 1 mm. The measurement range was: for excitation (Ex) - 240-540 nm, for emission (Em) - 260-600 nm. The total volume of all measured samples was 1.5 ml. Denaturation of the EGFP protein was carried out during 30 min in a 6 M solution of guanidine HCl (GdHCl). Iron oxide particles (FeO, Fe2O3, Fe3O4) coated with sodium citrate (TSC-IONP) were added to EGFP. Nanoparticles were obtained by chemical precipitation of oxide with ammonium hydrate from an aqueous solution of a mixture of iron chloride salts. Nanoparticles form self-organizing stable clusters ~10 and 50–80 nm in size, consisting of NPs 3 nm in size. Stability was monitored using the dynamic light scattering method.

Results

Fluorescence spectra of native EGFP were recorded. In addition to the main fluorescence peak Ex488nm/Em510nm (major peak), an Ex277nm/Em511nm peak (minor peak) was observed, the presence of which was explained earlier by the existence of two different conformations of this protein [2]. There was also a peak due to aromatic residues with a characteristic excitation wavelength in the region of 280 nm. During denaturation, complete quenching of the main and minor fluorescence peaks was observed. At the same time, the peak due to aromatic residues became more intense (approximately 2 times). This may be due to the release of hydrophobic residues on the surface of the protein during its denaturation.

To observe the process of denaturation over time, we measured the fluorescence kinetics (interval scan measurements) of this process. We were able to observe the quenching of fluorescence with time upon denaturation of EGFP at a concentration of 0.053 g/L: the intensity of the main maximum decreased by a factor of 2 in less than half a minute. We also found that, as the protein concentration increases, fluorescence quenching during its denaturation slows down. Thus, at a concentration of 0.067 g/L, the decrease in the intensity of the main maximum by a factor of 2 occurred already in approximately 0.8 min. This is probably due to a decrease in the ratio (number of GdHCl molecules)/(number of protein molecules) with increasing protein concentration.

We also conducted a study of the recovery of fluorescence of denatured EGFP upon renaturation of this protein by diluting (with water) its solution in GdHCl by 10 and 50 times. In the first case, the fluorescence signal was not restored, while at a 50-fold dilution (in this case, the final concentration of EGFP was 0.002 g/l), we found a recovery of the fluorescence intensity in the amount of 40% of the initial signal. Based on the assumption of a linear dependence of the protein concentration on the fluorescence intensity, this number can be considered as the percentage of renaturation.

Additionally, the effect of adding different amounts of TSC-IONP (concentration of 10 nm clusters ~10^13-10^14 ml^-1) on the fluorescence spectra was studied. In this case, only the change in the position of the fluorescence maximum was considered, since the change in the fluorescence intensity was, first of all, due to a decrease in the light transmission of the solution of nanoparticles with an increase in their concentration. It was found that when TSC-IONP is added, the main protein fluorescence maximum drifts towards longer wavelengths (the red shift). This may be due to a change in the environment with which the protein chromophore interacts electrostatically. It is known [3] that a number of polar groups and structured water molecules are buried adjacent to the chromophore. It is possible that the particles, through interaction with the outer surface of the protein, change this environment of the chromophore.

Conclusions

Thus, we were able to demonstrate partial EGFP renaturation and elucidate some details of the denaturation-renaturation process. We also established the red shift of the main protein fluorescence maximum upon the addition of iron oxide nanoparticles.

References

1. Ward WW, Bokman SH. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 1982 Sep 14;21(19):4535-40. doi: 10.1021/bi00262a003.

2. Dos Santos NV, Saponi CF, Greaves TL, Pereira JFB. Revealing a new fluorescence peak of the enhanced green fluorescent protein using three-dimensional fluorescence spectroscopy. RSC Adv. 2019 Jul 24;9(40):22853-22858. doi: 10.1039/c9ra02567g.

3. Tsien RY. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509-44. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.