Оптическая визуализация с использованием эндогенной флуоресценции ФАД, который участвует в процессах окисления жирных кислот, цикле Кребса и других окислительно-восстановительные реакциях, является одним из перспективных способов изучения метаболического статуса клеток. Возможность простого и неинвазивного определения ФАД основана на его автофлуоресценции, имеющей спектр возбуждения в диапазоне длин волн 350-500 нм с двумя пиками - при 370 и 450 нм, а спектр излучения приходится на область 500-600 нм с максимумом при 525 нм.

Согласно литературным источникам, клетки в разных физиологических состояниях имеют разные уровни интенсивности ФАД в зелено-синем спектре. Для определения физиологического состояния клеток по разнице в интенсивности сигнала ФАД в данной работе изучалась клеточная культура фибробластов кожи, после 20-дневного культивирования в питательной среде на основе DMEM (Gibco, Великобритания), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки (Biological Industries LDT, Израиль), пенициллин (100 ед/мл) (Gibco, США), стрептомицин (100 мкг/мл) (Gibco, США), в CO2-инкубаторе (Thermo Scientific) при 37°C, относительной влажности 100% и содержании CO2 5% (Eppendorf AG). Исследования проводились с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа ZEISS LSM 900 с системой Airyscan 2 (Carl Zeiss AG, Германия) при длине волны 488 нм.

На первом этапе исследования производилась посадка фибробластов на покровные стекла толщиной 0,5 мм с предварительно нанесенной сеткой для определения местоположения отдельных клеток. Как показывает выполненный анализ, в клеточной культуре присутствовали клетки как с высокой, так и с низкой интенсивностью флуоресценции. Это можно было бы объяснить тем фактом, что клетки имели разный метаболический статус и находились на разных стадиях развития. Это позволило на основе интенсивности сигнала автофлуоресценции разделить клетки на две подгруппы: – с высоким сигналом автофлуоресценции (предположительно стареющие или патологические) и клетки с низким сигналом.

Спустя 24 часа долю некротических в культуре клеток анализировали с помощью двойного окрашивания Hoechst 33342 (5 мкм) и йодидом пропидия (20 мкм) в течение 30 мин при 37°C. Для подсчета общего количества клеток использовали Hoechst 33342, который окрашивает ядра клеток в любом физиологическом состоянии. Йодид пропидия, не способный проникать через целые мембраны и окрашивать жизнеспособные клетки, применяли для окрашивания и подсчета некротических клеток.

Согласно полученным данным, доля некротических клеток среди клеток с высокой интенсивностью автофлуоресценции ФАД составила 47,4%, тогда как среди клеток с низким сигналом автофлуоресценции ФАД – 27,3%. Интенсивный сигнал ФАД может быть связан с сильно окисленным состоянием кофермента, входящего в структуру окислительно-восстановительных ферментов.

На следующем этапе исследования для определения структуры сигнала ФАД производилось поочередное внесение растворов адреналина (10 мкМ) для активации моноаминоксидазы (МАО-А), селегилина (20 мкМ) для ингибирования данного фермента, FCCP (2 мкМ), который является протонофором и приводит к разобщению дыхания митохондрий, а после – KCN (1мМ), который является ингибитором комплекса IV электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Это позволило определить уровень сигнала ФАД, связанного с МАО, а также общий пул ФАД комплекса II митохондрий. Было выявлено, что у клеток с высокой интенсивностью автофлуоресценции уровень МАО составил 12,3% ± 2,1 от общего сигнала автофлуоресценции, тогда как у клеток с низкой интенсивностью – 6,4% ± 0.9. Сочетание в клетках более высокого уровня пула МАО и пониженного уровня пула митохондриального ФАД может быть следствием образования при окислительном дезаминировании моноаминов соответствующих альдегидов, которые, как показывает анализ литературы, могут ингибировать сукцинатдегидрогеназу, в результате чего экспрессия данного фермента снижается. Таким образом, можно сделать вывод о нарушении работы комплекса II ЭТЦ.

Таким образом, данное исследование показывает возможность ранней диагностики различных заболеваний путем обнаружения сигнала автофлуоресценции ФАД и обнаружения клеток с высокой интенсивностью автофлуоресценции, которые преимущественно некротизированы. Низкий уровень жизнеспособности клеток с высокой интенсивностью автофлуоресценции в зелено-синем спектре может служить маркером, позволяющим осуществлять раннюю диагностику различных заболеваний, определяя точную локализацию и распространенность патологии в ткани. При этом повышенный сигнал ФАД обусловлен высокой активностью МАО, что позволяет в дальнейшем найти инструменты воздействия на данный фермент, предотвращая развитие патологического состояния клеток. Предложенный подход имеет важные преимущества, включая неинвазивность, высокую чувствительность, безопасность и может быть применен для ранней диагностики различных заболеваний и мониторинга реакции пациентов на терапевтические вмешательства, в том числе в режиме реального времени.

Работа выполнена при поддержке гранта Правительства Российской Федерации №075-15-2022-1095.

Optical imaging using endogenous fluorescence (FAD), which is involved in such processes as fatty acids oxidation, Krebs cycle and other redox reactions, is one of the promising ways to study the metabolic status of cells. The possibility of simple and non-invasiveness FAD determination is based on its autofluorescence, with an excitation spectrum in the wavelength range of 350-500 nm with two peaks - at 370 and 450 nm, and the emission spectrum falls in the region of 500-600 nm with a maximum at 525 nm.

According to literature sources, cells in different physiological states have different levels of FAD intensity in green-blue spectrum. To determine the physiological state of cells by the difference in the FAD intensity, in this work, a culture of skin fibroblasts was studied after after 20-day cultivation in DMEM-based growth medium (Gibco, UK) containing 4.5 g/l glucose, 10% fetal bovine serum (Biological Industries LDT, Israel), penicillin (100 units/ml) (Gibco, USA), streptomycin (100 µg/ml) (Gibco, USA), in a CO2 incubator (Thermo Scientific) at 37°C, 100% relative humidity and 5% CO2 content (Eppendorf AG). Studies were performed using a ZEISS LSM 900 laser scanning confocal microscope with Airyscan 2 system (Carl Zeiss AG, Germany) at a wavelength of 488 nm.

The first study stage, fibroblasts were planted on 0.5 mm thick coverslips with pre-applied mesh to locate the individual cells. As the performed analysis shows, cell culture contained cells with high and low fluorescence intensity. This could be explained by the difference in metabolic status of cells. This made it possible to divide the cells into two subgroups based on the intensity of the autofluorescence signal: with a high autofluorescence signal (presumably senescent or pathological) and with a low signal.

After 24 hours, the proportion of necrotic cells in the culture was analyzed by double staining with Hoechst 33342 (5 μM) and propidium iodide (20 μM) for 30 min at 37 °C. To count the total number of cells, Hoechst 33342 was used, which stains the nuclei of cells in any physiological state. Propidium iodide, unable to penetrate entire membranes and stain viable cells, was used for staining and counting necrotic cells.

The proportion of necrotic cells among cells with a high FAD autofluorescence intensity was 47.4%, whereas among cells with a low autofluorescence signal – 27.3%. Intense FAD signal can be associated with highly oxidized state of a coenzyme included in the structure of redox enzymes.

At the next stage of the study, to determine the structure of the FAD signal, different solutions were alternately introduced: adrenaline (10 μM) to activate MAO-A, selegiline (20 μM) to inhibit this enzyme, FCCP (2 μM), which is a protonophore and leads to the separation of mitochondrial respiration, and KCN (1 μM), which is an inhibitor of complex IV electron transport chain. This made it possible to determine the level of the FAD signal associated with MAO, as well as the total pool of FAD complex II of mitochondria. It was found that in cells with a high autofluorescence intensity, the pool MAO was 12.3% ± 2.1 of the total autofluorescence signal, whereas in cells with a low intensity this value was 6.4% ± 0.9. The combination in cells of a higher level of the MAO pool and a reduced level of the mitochondrial FAD pool may be a consequence of the formation of the corresponding aldehydes during oxidative deamination of monoamines, which can inhibit succinate dehydrogenase. As a result, the expression of this enzyme decreases, thus, the functioning of the complex II electron transport chain is impaired.

This study shows the possibility of early diagnosis of various diseases by detection of the FAD autofluorescence signal and by finding the cells with high fluorescence intensity, which are mostly necrotic. Low level viability of cells with high fluorescence intensity in a green-blue spectrum can be a marker for early diagnosis of various diseases, determining the exact localization and prevalence of pathology in the tissue. At the same time, the increased FAD signal is due to high MAO activity, which makes it possible to further find tools for influencing this enzyme, preventing the development of a pathological state of cells. The proposed approach has important advantages, including non-invasiveness, high sensitivity, safety and can be used for early diagnosis of various diseases and monitoring of patients' response to therapeutic interventions, including in real time.

This work was supported by the grant of the Russian Federation Government no. 075-15-2022-1095.