Потенциал-зависимый калиевый канал Kv1.3 играет ключевую роль в жизненно важных клеточных процессах: обеспечивает проводимость ионов калия через мембрану, участвует в распространении потенциала действия в мышечных клетках и нейронах, связан с пролиферацией и миграцией клеток. Kv1.3 вовлечён в патогенез некоторых онкологических [1] и аутоиммунных [2] заболеваний, а также болезней нервной системы [3].

Блокаторы поры этого канала, органические соединения и пептидные токсины, рассматриваются как перспективные лекарственные средства для лечения патологий, связанных с гиперэкспрессией или повышенной активностью канала [4, 5], а также служат инструментами для изучения его структуры и функционирования [6]. Поиск и изучение новых блокаторов требуют эффективной системы оценки их способности связываться с каналами.

Расширяя разнообразие методов изучения аффинности поровых блокаторов, мы докладываем о разработке аналитической системы для измерения сродства блокаторов к Kv1.3, экспрессированному на мембране клеток млекопитающих [7]. Компонентами системы являются пептид хонготоксин 1, конъюгированный с флуорофором Atto488 (A-HgTx), и канал Kv1.3 человека, слитый с красным флуоресцентным белком mKate2. Для измерений используется конфокальная микроскопия, а для оценки результатов разработан специальный протокол обработки изображений.

С использованием флуоресцентных маркеров клеточных органелл исследовано клеточное распределение каналов Kv1.3, слитых с mKate2 на N- или C-конце (K-Kv1.3 и Kv1.3-K, соответственно), при их транзиентной экспрессии в клетках HEK293. Установлено, что положение mKate2 в конструкции слитого белка влияет на локализацию канала в клетках. Представленность канала на мембране гораздо выше в случае K-Kv1.3, в то время как для Kv1.3-K наблюдалось преобладающее накопление канала в цитоплазме. Чтобы проверить возможность предсказанного ранее дополнительного усиления мембранной локализации Kv1.3 путем удаления его N-концевого фрагмента (которое не приводит к изменению свойств проводимости канала и аффинности поровых блокаторов [8, 9]), мы создали плазмиду, кодирующую усеченный Kv1.3, слитый по N-концу с mKate2 (K-∆Kv1.3). Показано, что для K-∆Kv1.3 характерна повышенная экспрессия в мембране, а общее распределение в клетке схоже с распределением K-Kv1.3.

Данные электрофизиологии показали, что K-∆Kv1.3, экспрессируемый в клетках, является функционально активным потенциал-зависимым каналом, который блокируется специфическими блокаторами Kv1.3-канала.

Все три исследованных варианта канала Kv1.3 связывают A-HgTx на мембране живых клеток. Это связывание наблюдается при наномолярных концентрациях A-HgTx и не приводит к заметным изменениям в мембранном распределении каналов Kv1.3. Промывка клеток свежей средой приводит к быстрой диссоциации A-HgTx с клеточной мембраны. Избыток немеченного HgTx1 вытесняет связанный A-HgTx с мембраны клеток. Не наблюдалось связывания A-HgTx с мембраной интактных клеток HEK293. Таким образом, связывание A-HgTx является специфическим и обратимым. Установлено, что связывание А-HgTx с Kv1.3 является концентрационно-зависимым и насыщаемым, а константа диссоциации комплексов составляет 0,48±0,08 нМ.

Эксперименты по конкурентному связыванию показали, что A-HgTx вытесняется из комплексов с K-∆Kv1.3 на мембране живых клеток различными известными пептидными поровыми блокаторами канала Kv1.3, включая рекомбинантные HgTx1, харибдотоксин (ChTx), агитоксин 2 (AgTx2) и калиотоксин 1 (KTx1), которые первоначально были обнаружены в ядах различных скорпионов. A-HgTx также вытесняется неспецифическим блокатором пор тетраэтиламмонием (TEA), который связывается как с внутренней стороной поры, так и с внешним вестибюлем Kv-каналов. Данные экспериментов по конкурентному связыванию были использованы для расчета кажущихся констант диссоциаций комплексов, которые составили 0,2±0,1; 4±2; 7±4 1,1±0,3; (2±1)×106 нМ для пептидов HgTx1, ChTx, AgTx2 и KTx1, а также неспецифического блокатора TEA, соответственно.

Результаты наших экспериментов демонстрируют, что при должном внимании к факторам, влияющим на взаимодействие блокаторов с каналом, разработанный аналитический подход, основанный на конфокальной флуоресцентной микроскопии комплексов A-HgTx с K-∆Kv1.3 каналами на мембране живых клеток, позволяет проводить скрининг блокаторов Kv1.3, которые связываются с внеклеточным вестибюлем K+-проводящей поры, и анализировать их аффинность.

Представленный подход дополняет арсенал методик в области исследований ионных каналов и потенциально может помочь в расширении библиотеки пептидных блокаторов канала Kv1.3, которые являются перспективными кандидатами для разработки на их основе лекарственных средств. Мы полагаем, что, варьируя флуоресцентный лиганд и тип экспрессируемого канала, разработанный подход может быть использован для изучения взаимодействий между различными группами пептидных блокаторов и ионных каналов на клеточном уровне.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (проект N 22-14-00406).



Литература

1) Teisseyre, A.; Palko-Labuz, A.; Sroda-Pomianek, K.; Michalak, K. Voltage-Gated Potassium Channel Kv1.3 as a Target in Therapy of Cancer. Front. Oncol. 2019, 9, 933.

2) Wulff, H.; Beeton, C.; Chandy, K.G. Potassium Channels as Therapeutic Targets for Autoimmune Disorders. Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2003, 6, 640–647.

3) Wang, X.; Li, G.; Guo, J.; Zhang, Z.; Zhang, S.; Zhu, Y.; Cheng, J.; Yu, L.; Ji, Y.; Tao, J. Kv1.3 Channel as a Key Therapeutic Target for Neuroinflammatory Diseases: State of the Art and Beyond. Front. Neurosci. 2020, 13, 1393.

4) Cañas, C.A.; Castaño-Valencia, S.; Castro-Herrera, F. Pharmacological Blockade of KV1.3 Channel as a Promising Treatment in Autoimmune Diseases. J. Transl. Autoimmun. 2022, 5, 100146.

5) Mathie, A.; Veale, E.L.; Golluscio, A.; Holden, R.G.; Walsh, Y. Pharmacological Approaches to Studying Potassium Channels. Handb. Exp. Pharm. 2021, 267, 83–111.

6) Kuzmenkov, A.I.; Grishin, E.V.; Vassilevski, A.A. Diversity of Potassium Channel Ligands: Focus on Scorpion Toxins. Biochemistry 2015, 80, 1764–1799.

7) Orlov, N.A.; Ignatova, A.A.; Kryukova, E.V.; Yakimov, S.A.; Kirpichnikov, M.P.; Nekrasova, O.V.; Feofanov, A.V. Combining mKate2-Kv1.3 Channel and Atto488-Hongotoxin for the Studies of Peptide Pore Blockers on Living Eukaryotic Cells. Toxins 2022, 14, 858.

8) Attali, B.; Romey, G.; Honore, E.; Schmid-Alliana, A.; Mattei, M.G.; Lesage, F.; Ricard, P.; Barhanin, J.; Lazdunski, M. Cloning, Functional Expression, and Regulation of Two K+ Channels in Human T Lymphocytes. J. Biol. Chem. 1992, 267, 8650–8657.

9) Voros, O.; Szilagyi, O.; Balajthy, A.; Somodi, S.; Panyi, G.; Hajdu, P. The C-Terminal HRET Sequence of Kv1.3 Regulates Gating Rather than Targeting of Kv1.3 to the Plasma Membrane. Sci. Rep. 2018, 8, 5937.

The voltage-gated potassium channel Kv1.3 plays a key role in vital cellular processes: it provides the conduction of potassium ions through the membrane, participates in the propagation of action potential in muscle cells and neurons, it is associated with cell proliferation and migration. Kv1.3 is involved in the pathogenesis of some oncological [1], autoimmune [2], and neuroinflammatory diseases [3].

Pore blockers of this channel - organic compounds and peptide toxins, are considered as promising therapeutic agents for the treatment of pathologies associated with overexpression or increased activity of the channel [4, 5], and also serve as tools for studying its structure and functioning [6]. The search and study of new blockers require an effective system for assessing their ability to bind to the channels.

Expanding the variety of methods for studying the affinity of pore blockers, we report on the development of an analytical system for measuring the affinity of blockers to Kv1.3 expressed on the membrane of mammalian cells [7]. The components of the system are the peptide Hongotoxin 1 conjugated with the fluorophore Atto488 (A-HgTx), and the human Kv1.3 channel fused with the red fluorescent protein mKate2. Confocal microscopy is used for measurements, and a special image processing protocol has been developed to evaluate the results.

The cellular distribution of Kv1.3 channels fused with mKate2 at the N- or C-terminus (K-Kv1.3 and Kv1.3-K, respectively) during their transient expression in HEK293 cells was studied using fluorescent markers of cellular organelles. It was found that the position of mKate2 in the structure of the merged protein affects the localization of the channel in cells. The representation of the channel on the membrane is much higher in the case of K-Kv1.3, while for Kv1.3-K, the predominant accumulation of the channel in the cytoplasm is observed. To test the possibility of the previously described additional amplification of the membrane localization of Kv1.3 by removing its N-terminal fragment (which does not change the properties of the channel conductivity and the affinity of pore blockers [8, 9]), we created a plasmid encoding a truncated Kv1.3 fused at the N-terminus with mKate2 (K-∆Kv1.3). It is shown that K-∆Kv1.3 is characterized by increased expression in the membrane, and the overall distribution in the cell is similar to the distribution of K-Kv1.3.

Electrophysiology data have shown that K-Kv1.3 expressed in cells is a functionally active voltage-gated channel that is blocked by specific Kv1.3-channel blockers.

All three investigated variants of the Kv1.3 channel bind A-HgTx on the membrane of living cells. This binding is observed at nanomolar concentrations of A-HgTx and does not lead to noticeable changes in the membrane distribution of Kv1.3 channels. Washing cells with fresh medium leads to rapid dissociation of A-HgTx from the cell membrane. An excess of unlabeled HgTx1 displaces bound A-HgTx from the cell membrane. No binding of A-HgTx to the membrane of intact HEK293 cells was observed. Thus, the binding of A-HgTx is specific and reversible. It was found that the binding of A-HgTx to Kv1.3 is concentration-dependent and saturable, and the dissociation constant of the complexes amounts to 0.48±0.08 nM.

Competitive binding experiments have shown that A-HgTx is displaced from complexes with K-∆Kv1.3 on the membrane of living cells by various known peptide pore blockers of the Kv1.3 channel, including recombinant HgTx1, Charybdotoxin (ChTx), Agitoxin 2 (AgTx2), and Kaliotoxin 1 (KTx1), which were originally found in the poisons of various scorpions. A-HgTx is also displaced by the nonspecific pore blocker tetraethylammonium (TEA), which binds to both the inner side of the pore and the outer vestibule of the Kv channels. Data from competitive binding experiments were used to calculate the apparent dissociation constants of complexes, which equaled to 0,2±0,1; 4±2; 7±4 1,1±0,3; (2±1)×106 nM for peptides HgTx1, ChTx, AgTx2, KTx1, and a non-specific blocker TEA, respectively.

The results of our experiments demonstrate that with due attention to the factors affecting the interaction of blockers with the channel, the developed analytical approach based on confocal fluorescence microscopy of A-HgTx complexes with K-∆Kv1.3 channels on the membrane of living cells allows screening of Kv1.3 blockers that bind to the extracellular vestibule of K+-conducting pores, and analyze their affinity.

The presented approach complements the arsenal of techniques in the field of ion channel research and can potentially help in expanding the library of peptide blockers of the Kv1.3 channel, which are promising candidates for the development of therapeutic agents based on them. We believe, that by varying the fluorescent ligand and the type of channel expressed, the developed approach can be used to study interactions between different groups of peptide blockers and ion channels at the cellular level.

The research was funded by the Russian Science Foundation (project N 22-14-00406).



References

1) Teisseyre, A.; Palko-Labuz, A.; Sroda-Pomianek, K.; Michalak, K. Voltage-Gated Potassium Channel Kv1.3 as a Target in Therapy of Cancer. Front. Oncol. 2019, 9, 933.

2) Wulff, H.; Beeton, C.; Chandy, K.G. Potassium Channels as Therapeutic Targets for Autoimmune Disorders. Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2003, 6, 640–647.

3) Wang, X.; Li, G.; Guo, J.; Zhang, Z.; Zhang, S.; Zhu, Y.; Cheng, J.; Yu, L.; Ji, Y.; Tao, J. Kv1.3 Channel as a Key Therapeutic Target for Neuroinflammatory Diseases: State of the Art and Beyond. Front. Neurosci. 2020, 13, 1393.

4) Cañas, C.A.; Castaño-Valencia, S.; Castro-Herrera, F. Pharmacological Blockade of KV1.3 Channel as a Promising Treatment in Autoimmune Diseases. J. Transl. Autoimmun. 2022, 5, 100146.

5) Mathie, A.; Veale, E.L.; Golluscio, A.; Holden, R.G.; Walsh, Y. Pharmacological Approaches to Studying Potassium Channels. Handb. Exp. Pharm. 2021, 267, 83–111.

6) Kuzmenkov, A.I.; Grishin, E.V.; Vassilevski, A.A. Diversity of Potassium Channel Ligands: Focus on Scorpion Toxins. Biochemistry 2015, 80, 1764–1799.

7) Orlov, N.A.; Ignatova, A.A.; Kryukova, E.V.; Yakimov, S.A.; Kirpichnikov, M.P.; Nekrasova, O.V.; Feofanov, A.V. Combining mKate2-Kv1.3 Channel and Atto488-Hongotoxin for the Studies of Peptide Pore Blockers on Living Eukaryotic Cells. Toxins 2022, 14, 858.

8) Attali, B.; Romey, G.; Honore, E.; Schmid-Alliana, A.; Mattei, M.G.; Lesage, F.; Ricard, P.; Barhanin, J.; Lazdunski, M. Cloning, Functional Expression, and Regulation of Two K+ Channels in Human T Lymphocytes. J. Biol. Chem. 1992, 267, 8650–8657.

9) Voros, O.; Szilagyi, O.; Balajthy, A.; Somodi, S.; Panyi, G.; Hajdu, P. The C-Terminal HRET Sequence of Kv1.3 Regulates Gating Rather than Targeting of Kv1.3 to the Plasma Membrane. Sci. Rep. 2018, 8, 5937.