Раскрытие механизмов влияние сред с различными физико-химическими характеристиками на ферментативный катализ является ключевой задачей для понимания принципов регуляции биохимических процессов в живой клетке (= в динамичном микроокружении сложного состава). Активность ферментов в клетке определяется многими факторами, среди которых значительную роль играет вязкость среды. Добавление различных сорастворителей в традиционные буферные растворы помогает имитировать внутриклеточные условия in vitro, позволяя уменьшить число сочетающихся регуляторных эффектов. Биолюминесцентная реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, представляет собой многостадийный процесс, включающий образование и распад как минимум четырёх интермедиатов. Механизмы влияния вязкости среды на такой биохимический процесс всё еще не установлены окончательно.

Целью данного исследования было определение диффузионно-контролируемых стадий реакции, катализируемой бактериальной люциферазой P. leiognathi. Для этого были проанализированы константы скорости отдельных стадий реакции в средах с повышенной вязкостью (до 6 сП), созданных добавлением сорастворителей различной молекулярной массы (этиленгликоль, глицерин, глюкоза, сорбитол, сахароза, декстран с молекулярной массой около 70 кДа и полиэтиленгликоль с молекулярной массой около 4 кДа). Константы скорости вычисляли на основе нестационарной кинетики реакции, измеренной методом остановленного потока, с помощью математической модели, учитывающей последовательность стадий реакции. Модель была разработана в лаборатории теоретической биофизики Института биофизики СО РАН. Также было проведено вычисление молекулярной динамики бактериальной люциферазы в окружении воды и сорастворителей для обнаружения возможного изменения структуры белка в вязких средах. Кроме того, межмолекулярные взаимодействия люциферазы с сорастворителями исследовали методом флуоресцентной спектроскопии.

Было получено, что константы скорости связывание восстановленного флавинмононуклеотида и длинноцепочечного альдегида (образования интермедиатов I и IIA) зависят от вязкости среды по степенному закону, то есть проявляют свойства диффузионно-контролируемых процессов. В то же время скорость связывания кислорода (образования интермедиата II) не зависит от вязкости среды. Скорости «темновых» стадий реакции (окисления восстановленного флавина и распада интермедиата II) тоже испытывали диффузионные ограничения в вязких средах, но это не приводило к увеличению общего квантового выхода реакции. Каталитическая константа бактериальной люциферазы оказалась не зависящей от вязкости среды: наблюдалось её увеличение в средах с глюкозой, сорбитолом и сахарозой, и уменьшение – в средах с этиленгликолем и декстраном.

Молекулярная динамика бактериальной люциферазы в окружении низкомолекулярных сорастворителей показала, что в присутствии этиленгликоля увеличивается поверхность белка, доступная растворителю, в то время как в остальных случаях она не изменяется. Кроме того, было установлено предпочтительное связывание люциферазы с глюкозой, сорбитолом и сахарозой, но не с этиленгликолем и глицерином.

Было получено, что спектры флуоресценции бактериальной люциферазы при возбуждении 295 нм проявляли гипсохромный сдвиг в присутствии глюкозы и сахарозы, что говорит о переходе триптофановых остатков в менее полярное окружение, чем в буфере. Этиленгликоль и полимерные сорастворители не влияли на спектр люминесценции белка.

Таким образом, на основе результатов экспериментов и молекулярного моделирования получена целостная картина влияния вязких сред на биолюминесцентную реакцию, катализируемую люциферазой P. leiognathi: (i) замедление диффузии компонентов реакции приводит к снижению скорости связывания флавинового и альдегидного субстрата, но также способствует замедлению конкурирующих «темновых» стадий реакции; (ii) наблюдается преферативное связывание с поверхностью люциферазы некоторых сорастворителей, что коррелирует с увеличением каталитической константы фермента в их присутствии; (iii) растворы биополимеров влияют в соответствии со своей низкой вязкостью и молярной концентрацией, дополнительных эффектов вследствие явления макромолекулярного краудинга не наблюдается.

Revealing the mechanisms of the influence of media with different physicochemical characteristics on enzymatic catalysis is a key task for understanding the principles of regulation of biochemical processes in a living cell (= in a dynamic microenvironment of a complex composition). The activity of enzymes in a cell is determined by many factors, among which a significant role is played by the viscosity of the medium. The addition of various co-solvents to traditional buffer solutions is used to mimic intracellular conditions in vitro, allowing for the reduction of co-regulatory effects. The bioluminescent reaction catalyzed by bacterial luciferase is a multistage process that includes the formation and degradation of at least four intermediates. The mechanisms of the influence of the medium viscosity on such a biochemical process have not yet been fully established.

The aim of this study was to determine the diffusion-controlled steps of the reaction catalyzed by the bacterial luciferase P. leiognathi. To achieve this, we analyzed the rate constants of individual reaction steps in media with increased viscosity (up to 6 cP) created by adding cosolvents of various molecular weights (ethylene glycol, glycerol, glucose, sorbitol, sucrose, dextran with a molecular weight of about 70 kDa and polyethylene glycol with a molecular weight of about 4 kDa). The rate constants were calculated based on the non-stationary reaction kinetics measured by the stopped flow method using a mathematical model that takes into account the sequence of reaction stages. The model was developed in the Laboratory of theoretical biophysics of the Institute of Biophysics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences. Also, the calculation of the molecular dynamics of bacterial luciferase surrounded by water and cosolvents was performed to detect a possible change in the structure of the protein in viscous media. In addition, intermolecular interactions of luciferase with cosolvents were studied by fluorescent spectroscopy technique.

It was found that the rate constants of binding of reduced flavin mononucleotide and long-chain aldehyde (formation of intermediates I and IIA) depend on the viscosity of the medium according to a power law, that is, they exhibit the properties of diffusion-controlled processes. At the same time, the rate of oxygen binding (formation of intermediate II) does not depend on the viscosity of the medium. The rates of the "dark" stages of the reaction (oxidation of the reduced flavin and decomposition of intermediate II) also exhibited diffusion limitations in viscous media, but this did not lead to an increase in the overall quantum yield of the reaction. The catalytic constant of bacterial luciferase turned out to be independent of the viscosity of the medium: it increased in media with glucose, sorbitol, and sucrose, and decreased in media with ethylene glycol and dextran.

The molecular dynamics of bacterial luciferase in the environment of low molecular weight cosolvents showed that in the presence of ethylene glycol, the solvent accessible surface area of the protein increases, while in other cases it does not change. In addition, the preferential binding of glucose, sorbitol and sucrose to luciferase, but not of ethylene glycol and glycerol, has been established.

It was found that the fluorescence spectra of bacterial luciferase upon excitation at 295 nm showed a hypsochromic shift in the presence of glucose and sucrose, which indicates the transition of tryptophan residues to a less polar environment than in the buffer. Ethylene glycol and polymer cosolvents did not affect the luminescence spectrum of the protein.

Thus, based on the results of experiments and molecular modeling, a complete picture of the effect of viscous media on the bioluminescent reaction catalyzed by P. leiognathi luciferase was obtained: (i) slowing down the diffusion of the reaction components leads to a decrease in the rate of binding of the flavin and aldehyde substrates, but also helps to slow down the competing "dark" stages of the reaction; (ii) there is a preferential binding to the surface of the luciferase of some cosolvents, which correlates with an increase in the catalytic constant of the enzyme in their presence; (iii) biopolymer solutions are affected according to their low viscosity and molar concentration, no additional effects due to the macromolecular crowding are observed.