Изучение спектров поглощения биомолекул остается одним из наиболее эффективных и доступных методов при анализе структурных свойств биомолекул. Спектральные свойства белковых макромолекул исследуются в основном в области поглощения боковых групп ароматических аминокислот в диапазоне длин волн 240 - 320 нм. Часто детектируемые изменения связываются с разворачиванием/сворачиванием белковой глобулы, сопровождающимся экспонированием/экранированием ее хромофорных групп относительно поверхности белковой макромолекулы.

Объекты исследования – растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) и бычьей панкреатической РНКазы А в концентрации 1•10-5 моль/л в 0.1 моль/л Na-фосфатном буфере (pH 7.4).

Растворы БСА и РНКазы облучали УФ-светом с помощью облучателя Bio-Link-BLX (Vilber Lourmat, Франция) в узких диапазонах длин волн: с λmax 254 нм. Интенсивность облучения 1 лампы из 6 - 0,3 Дж/(см²•мин). Регистрировали спектры поглощения растворов сывороточного альбумина на спектрофотометре UV-2401 PC («Shimadzu», Япония) в диапазоне длин волн от 240 до 400 нм, спектральная ширина щели 0.5 нм, шаг сканирования 0.5 нм, скорость сканирования соответствовала режиму Slow. Измерения были проведены в стандартной кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Увеличение разрешения в спектрах поглощения образцов осуществлялось путем вычисления второй производной.

Сложная полоса поглощения исследуемых белков в области 250-300 нм обусловлена светопоглощением фенилаланина (коротковолновое плечо полосы поглощения), триптофана и тирозина. Из анализа производной спектра поглощения нативного БСА следует, что локальные максимумы (переходы в полосе поглощения) наблюдаются при длинах волн: λ = 242,9; 255,8; 262,5; 267,0; 271,2; 282,1; 289,2 и 295,2 нм; наиболее отчетливо выражен максимум поглощения при 282,1 нм, он обусловлен присутствием триптофана в составе альбумина. Спектр поглощения РНКазы имеет максимум поглощения при λmax = 276,6 нм, который обусловлен наличием тирозина в составе рибонуклеазы. Такой вид спектра, в котором хорошо наблюдается только один максимум, объясняется значительными отличиями аминокислотного состава исследуемых белков: в молекуле БСА 30 остатков фенилаланина, 21 – тирозина и 3 – триптофана, тогда как в РНКазе всего 3 остатка фенилаланина и 6 – тирозина. Главный вклад в спектр поглощения РНКазы вносит тирозин, что обусловлено отсутствием триптофана, именно с этим связано более коротковолновое положение максимума поглощения (по сравнению с БСА). Низкая молекулярная масса, меньшее количество ароматических аминокислот и отсутствие триптофана являются причиной более низкой оптической плотности, и, соответственно, низкого коэффициента экстинкции рибонуклеазы.

Под действием УФ-света происходит повышение оптической плотности белковых растворов во всем исследуемом диапазоне длин волн. При этом повышение оптической плотности относительно нативного белка для РНКазы составило при действии УФ-света в дозе 755 Дж/м² 22,5 %; при 1510 Дж/м² – 37,5 %; 3020 Дж/м² – 32,3 %. Для БСА повышение оптической плотности относительно нативного белка при облучении в дозе 3020 Дж/м² – 6 %, что указывает на его большую фотостабильность.

При этом в спектрах УФ-облученных белков не изменяется положение характеристических точек по сравнению с нативным образцом, следовательно, не происходит образования окисленных продуктов ароматических аминокислот, возможное изменение микроокружения хромофорных групп не приводит к сдвигу длин волн электронных переходов в ароматических радикалах аминокислот.

Измеренная оптическая плотность –это сумма истинного значения оптической плотности и оптической плотности, обусловленной рассеиванием света. Вклад светорассеяния можно учесть путем экстраполяции значений оптической плотности из области, где отсутствует вклад истинного поглощения хромофорами (в данном случае – 340 - 400 нм). Для учета вклада светорассеяния использовали формулу Dрас=10^a٠λ^n, а и n – эмпирические коэффициенты, характеризующие светорассеяние. В таблице приведены значения данных коэффициентов в зависимости от дозы облучения.

Таблица

Оценка вклада светорассеяния с помощью эмпирических коэффициентов

Коэффициент n а

Объект БСА РНКаза БСА РНКаза

Нативный белок 1,54 1,33 2,71 1,22

755 Дж/м² 1,93 0,96 3,69 0,8

1510 Дж/м² 2,17 2.18 4,36 3,95

3020 Дж/м² 2,44 1,29 5,06 1,82



Зависимость полученных коэффициентов для БСА линейная, для РНКазы мы видим неоднонаправленные изменения данного параметра, что, по-видимому, указывает и на неоднонаправленные изменения объема белковой глобулы.

Полученные нами данные показывают, что, используя спектрофотометрический метод, можно корректным образом описать структурные изменения в молекуле белка.

The study of absorption spectra of biomolecules remains one of the most effective and accessible methods for analyzing the structural properties of biomolecules. The spectral properties of protein macromolecules are studied mainly in the absorption region of the side groups of aromatic amino acids in the wavelength range 240 - 320 nm. Often detected changes are associated with the unfolding/folding of the protein globule, accompanied by exposure/screening of its chromophore groups relative to the surface of the protein macromolecule.

The objects of the study are solutions of bovine serum albumin (BSA) and bovine pancreatic RNase A at a concentration of 1•10-5 mol/l in 0.1 mol/l Na–phosphate buffer (pH 7.4).

Solutions of BSA and RNase were irradiated with UV light using a Bio-Link-BLX irradiator (Vilber Lourmat, France) in narrow wavelength ranges: with λmax 254 nm. The irradiation intensity of 1 lamp out of 6 is 0.3 J/ (cm²•min). Absorption spectra of serum albumin solutions were recorded on a UV-2401 PC spectrophotometer (Shimadzu, Japan) in the wavelength range from 240 to 400 nm, spectral slit width 0.5 nm, scanning step 0.5 nm, scanning speed corresponded to the Slow mode. The measurements were carried out in a standard quartz cuvette with an optical path length of 10 mm. The resolution increase in the absorption spectra of the samples was carried out by calculating the second derivative.

The complex absorption band of the studied proteins in the region of 250-300 nm is due to the light absorption of phenylalanine (the short-wavelength shoulder of the absorption band), tryptophan and tyrosine. From the analysis of the derivative of the absorption spectrum of the native BSA, it follows that local maxima (transitions in the absorption band) are observed at wavelengths: λ = 242,9; 255,8; 262,5; 267,0; 271,2; 282,1; 289,2 and 295.2 nm; the absorption maximum is most clearly expressed at 282.1 nm, it is due to the presence of tryptophan in albumin. The absorption spectrum of RNase has an absorption maximum at λmax = 276.6 nm, which is due to the presence of tyrosine in the ribonuclease. This type of spectrum, in which only one maximum is well observed, is explained by significant differences in the amino acid composition of the studied proteins: in the BSA molecule there are 30 phenylalanine, 21 – tyrosine and 3 – tryptophan residues, whereas in the RNase there are only 3 phenylalanine and 6 – tyrosine residues. The main contribution to the absorption spectrum of RNase is made by tyrosine, which is due to the absence of tryptophan, which is why the shorter-wavelength position of the absorption maximum (compared to BSA) is associated with this. The low molecular weight, fewer aromatic amino acids and the absence of tryptophan are the reason for the lower optical density, and, accordingly, the low extinction coefficient of ribonuclease.

Under the influence of UV light, the optical density of protein solutions increases throughout the studied wavelength range. At the same time, the increase in optical density relative to the native protein for RNase was 22.5% under the action of UV light at a dose of 755 J/m²; at 1510 J/m² - 37.5%; 3020 J/m² – 32.3%. For BSA, an increase in the optical density relative to the native protein when irradiated at a dose of 3020 J/m² is - 6%, which indicates its greater photostability.

At the same time, the position of characteristic points in the spectra of UV-irradiated proteins does not change in comparison with the native sample, therefore, there is no formation of oxidized products of aromatic amino acids, a possible change in the microenvironment of chromophore groups does not lead to a shift in the wavelengths of electronic transitions in aromatic amino acid radicals.

The measured optical density is the sum of the true value of the optical density and the optical density due to light scattering. The contribution of light scattering can be taken into account by extrapolating the optical density values from the region where there is no contribution of true absorption by chromophores (in this case, 340 – 400 nm). To account for the contribution of light scattering, the formula Dls=10^a٠λ^n was used, where a and n are empirical coefficients characterizing light scattering. The table shows the values of these coefficients depending on the radiation dose.

Table

Estimation of the light scattering contribution using empirical coefficients

Coefficient n а

Object BSA RNKaza BSA RNKaza

Native protein 1,54 1,33 2,71 1,22

755 Дж/м² 1,93 0,96 3,69 0,8

1510 Дж/м² 2,17 2.18 4,36 3,95

3020 Дж/м² 2,44 1,29 5,06 1,82



The dependence of the obtained coefficients for BSA is linear, for RNase we see non-directional changes in this parameter, which, apparently, indicates non-directional changes in the volume of the protein globule.

The data obtained by us show that, using the spectrophotometric method, it is possible to correctly describe the structural changes in the protein molecule.