Синглетный кислород (СК) является высокореакционной формой молекулярного кислорода и играет важную роль во многих физических, химических и биологических процессах, а также в терапии различных патологий. Повышение интереса к СК вследствие его высокой химической активности способствовало разработке различных подходов к его генерации в биологических средах. Так, в последнее время активно изучается механизм прямой оптической генерации СК светом определённых длин волн без использования фотосенсибилизаторов. Наравне с исследованием влияния лазерно-индуцированного СК на протекание физиологических процессов на клеточном и тканевом уровнях активно разрабатываются и изучаются подходы к его обнаружению и количественному определению. Это является важной задачей для оценки эффективных доз и поиска оптимальных параметров возбуждения триплетного кислорода. В этой работе изучена влияние ряда длин волн, мощностей и экспозиций лазерного излучения на генерацию СК, а также проанализированы преимущества и недостатки существующих подходов к количественному измерению образования СК.

На сегодняшний день из-за высокой реакционной способности СК существует ограниченное количество возможных подходов к его детектированию. В работе рассмотрены полярографический метод с использованием респирометра Oxytherm+R (Hansatech Instruments, Великобритания) и метод с применением флуоресцентного зонда Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG, Invitrogen, США). Поскольку основное триплетное состояние кислорода имеет несколько полос поглощения в спектральном диапазоне от 390 нм до 1300 нм, при которых возможно образование СК, рассмотрены длины волн лазерного излучения 1267 нм и 1064 нм. Данные длины волн обладают наибольшим поглощением триплетной формой кислорода. В работе источники лазерного излучения 1244 нм и 1122 нм использованы в качестве контрольных, которые, по литературным данным, не активируют переход триплетного кислорода в синглетное состояние.

Исследование полярографическим методом включало измерение уровня растворённого кислорода в ddH2O и 5 мМ растворе L-гистидина в ddH2O. L-гистидин использован в качестве «химической ловушки» благодаря его способности к взаимодействию с СК, что делало возможным полярографическое измерение снижения концентрации растворённого кислорода. Лазерно-индуцированная генерация СК осуществлялась через стеклянную стенку измерительной камеры, в которой поддерживалась температура 26 °С. Измерение с применением селективного флуоресцентного зонда SOSG осуществлялось с использованием микроскопа Zeiss LSM 900 (Carl Zeiss AG, Германия) с объективом 10×. Для возбуждения флуоресценции зонда использовался лазер с длиной волны 488 нм и мощностью 0,1 % от максимальной. Подача лазерного излучения в ходе экспериментов осуществлялась с противоположной стороны от объектива микроскопа. Протокол включал этапы регистрации базового уровня сигнала (3 мин), уровня сигнала в процессе генерации СК лазерным излучением (длительность зависела от выбранной дозы), а также регистрацию сигнала после воздействия (6 мин). Анализ влияния факторов времени (экспозиции лазерного излучения) и мощности на образование СК осуществлялся при воздействии различных доз (50, 100, 150, 200 и 250 Дж/см2) лазерного излучения при фиксированном значении мощности 50 мВт, а также для дозы 200 Дж/см2 при различных мощностях равных 50, 100 и 150 мВт.

Анализ результатов измерений полярографическим методом показал, что содержание растворённого кислорода в растворе L-гистидина в измерительной камере после воздействия излучением на длинах волн 1267 нм и 1064 нм оказалось ниже по сравнению с контрольными лазерами. Однако, несмотря на показанные различия между исследуемыми лазерами, данный подход характеризуется недостаточной чувствительностью к детектированию различных доз генерируемого СК. Кроме того, чувствительность полярографического метода к изменению температуры даже при её стабилизации, предусмотренной конструкцией респирометра, делает невозможным анализ изменения сигнала в момент лазерного воздействия. Поэтому можно сделать лишь косвенную оценку после расчёта конечного снижения концентрации кислорода по сравнению с исходным её уровнем до воздействия.

Измерения с применением SOSG показали, что воздействие излучением 1267 и 1064 нм приводит к усилению интенсивности зелёной флуоресценции окисленной формы данного зонда. Прирост сигнала свидетельствует о продукции СК и его селективном взаимодействии с SOSG. При этом длина волны 1267 нм оказывает более значительное влияние. Увеличение интенсивности флуоресценции зарегистрировано и при воздействии излучением с длиной волны 1244 нм, что может указывать на образование СК и некорректное его использовании в качестве контрольного лазера. Анализ результатов при воздействии различных доз излучения показал чувствительность подхода к различиям в количестве генерируемого СК. Воздействие мощностями 50, 100 и 150 мВт дозой 200 Дж/см2 выявило большее влияние на количество выработанного СК фактора времени воздействия, чем мощности, что вероятнее всего связано с малым временем жизни СК.

Рассмотренные подходы к обнаружению лазерно-индуцированного СК характеризуются разной чувствительностью к его обнаружению. Данные методы позволяют осуществить лишь косвенную оценку и не могут обеспечить контроль и управление генерацией СК в процессе лазерного воздействия. В случае полярографического метода можно измерить только образующийся в растворе или диффундирующий из ткани СК. Но последнее представляется невозможным из-за малого времени жизни СК. Применение SOSG существенно ограничено его низкой проникающей способностью через клеточную мембрану. Всё это указывает на необходимость разработки новых высокочувствительных методов детекции СК.

Работа выполнена при поддержке РНФ в рамках проектов №22-75-10088 (дизайн эксперимента, разработка лазерных источников, определение чувствительности методов обнаружения СК) и №21-75-00086 (анализ дозозависимого эффекта при воздействии лазером с длиной волны 1267 нм).

Singlet oxygen (SO) is a highly reactive form of molecular oxygen and plays an important role in many physical, chemical, and biological processes, as well as in the therapy of different pathologies. The growing interest in SO due to its high chemical activity has contributed to the development of various approaches to SO generation in biological systems. Thus, the mechanism of direct photosensitizer-free optical generation of the singlet form of oxygen by light at specific wavelengths has been actively studied recently. Along with the study of the effect of laser-induced SO on physiological processes at the cellular and tissue levels, approaches to its detection and quantification are being actively developed and studied. This is an important task for evaluating effective doses and searching for optimal parameters of triplet oxygen excitation. In this work, the influence of a number of wavelengths, powers and exposures of laser radiation on SO generation is studied, and the advantages and disadvantages of existing approaches to the quantitative measurement of SO formation are analyzed.

To date, due to the high reactivity of SO, there are a limited number of possible approaches to its detection. The paper considers a polarographic method using an Oxytherm+R respirometer (Hansatech Instruments, UK) and a method using a Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) fluorescent probe (Invitrogen, USA). The ground triplet state of oxygen has several absorption bands in the spectral range from 390 to 1300 nm, at which SO can be produced. The laser wavelengths of 1267 and 1064 nm, which have the greatest absorption by the triplet form of oxygen, are considered. In this work, 1244 and 1122 nm laser radiation sources were used as controls. According to the data from literature, they do not activate the transition of triplet oxygen to the singlet state.

The study by polarographic method included measurement of the level of dissolved oxygen in ddH2O or 5 mM L-histidine solution in ddH2O. L-histidine was used as a “chemical trap” due to its ability to interact with SO. This made possible the polarographic measurement of the decrease in the dissolved oxygen concentration. Laser-induced SO generation was carried out through the glass wall of the measuring chamber, in which the temperature was maintained at a level of 26 °C. Measurements were made using a Zeiss LSM 900 microscope (Carl Zeiss AG, Germany) with a 10× objective. To excite the fluorescence of the probe, a laser with a wavelength of 488 nm and a power of 0.1 % of the maximum was used. The delivery of laser radiation during the experiments was carried out from the opposite side of the microscope objective. The study protocol included the stages of recording the baseline signal level (3 min), the signal level in the process of SO generation by laser radiation (the duration depended on the selected dose), and recording the signal after laser exposure (6 min). The analysis of the influence of time (laser radiation exposure) and power factors on the formation of SO was carried out when exposed to different doses (50, 100, 150, 200 and 250 J/cm2) of laser radiation at a fixed power value of 50 mW, as well as for a dose of 200 J/cm2 at different powers equal to 50, 100 and 150 mW.

An analysis of the measurement results by the polarographic method showed that the content of dissolved oxygen in the L-histidine solution in the measuring chamber after 1267 nm and 1064 nm laser exposure turned out to be lower compared to the control lasers. However, this approach is characterized by insufficient sensitivity to the detection of various doses of generated SO. In addition, the sensitivity of the polarographic method to temperature changes, despite its stabilization by the design of the respirometer, makes it impossible to analyse the change in the signal at the time of laser exposure. Therefore, only an indirect estimate can be made after calculating the final decrease in oxygen concentration compared to its initial level before exposure.

Measurements using SOSG fluorescent probe showed that 1267 and 1064 nm laser exposure leads to an increase in the green fluorescence intensity of the probe oxidized form. The increase in the signal indicates the production of SO and its selective interaction with SOSG. At the same time, the wavelength of 1267 nm has a more significant influence. An increase in fluorescence intensity was also registered under laser irradiation at a wavelength of 1244 nm. This result may indicate the formation of SO and the incorrect use of this radiation source as a control laser. An analysis of the results under the influence of different doses of laser radiation showed the sensitivity of the approach to differences in the amount of SO generated. Exposure with a power of 50, 100 and 150 mW at a dose of 200 J/cm2 revealed a greater influence of exposure time than power on the amount produced SO. This is most likely due to the short lifetime of the SO.

The considered approaches for the detection of SO generation are characterized by different sensitivity to its detection. These methods allow one to realize only an indirect estimation and cannot provide SO-generation control during the laser exposure. In the case of the polarographic method only SO generated in solution or diffused from the tissue can be measured. But the last seems impossible due to the low SO lifetime. The use of SOSG is significantly limited by its poor penetrating ability through the cell membrane. Therefore, the use of chemical traps or specialized fluorescent probes is suitable only for a narrow type of tasks. This indicates the need to develop new highly sensitive SO detection methods.

The study was supported by the Russian Science Foundation under the projects No.22-75-10088 (experiment design, development of laser sources, determination of sensitivity of SO detection methods) and No.21-75-00086 (analysis of the dose-dependent effect during 1267 nm laser exposure).