В Российской Федерации по данным Минздрава каждый год диагностируют около 10 000 новых случаев заболевания меланомой. Современные методы терапии этого заболевания основаны либо на хирургическом вмешательстве, либо на использовании химиотерапии. Однако эти методы сопряжены с большим количеством побочных эффектов и часто бывают неэффективны. Альтернативой этим способам лечения может стать фототермическая терапия.[1] Этот метод заключается в накоплении наночастиц в зоне опухоли и последующим воздействием на них лазерным излучением для нагрева. Однако нагрев и чрезмерное изменение температуры сильно влияют на такие клеточные функции как деление клеток, экспрессия генов, активность факторов роста и метаболизм.[2] Таким образом, мониторинг температуры в режиме реального времени в процессе внешнего нагрева необходим не только для прогнозирования поведения клеток, но и для предотвращения возможных побочных эффектов в ходе терапии.[3,4]

Один из методов измерения температуры вне и внутри клеток основан на сдвиге стоксовой компоненты комбинационного рассеяния, например, от кремниевых наночастиц. Они способны преобразовывать лазерное излучение в тепловую энергию.[5,6] Также такие диэлектрические наночастицы обладают оптически индуцированными магнитными и электрическими резонансами Ми типа, что позволяет им не только усиливать сигнал рамановского рассеяния, но и эффективно поглощать свет и стимулировать оптический нагрев. Все вышеописанные достоинства кремниевых наночастиц делают эти носители пригодными для проведения онкотерапии с минимальным количеством побочных эффектов из-за контроля температуры.

Сначала было теоретически рассчитано, что диаметр кремниевых частиц около 180 нм наиболее эффективен для нагрева. Затем были синтезированы подходящие кремниевые частицы методом лазерной абляции под слоем жидкости. В качестве подложки использовалась кремниевая пластина, а процесс абляции происходил в воде. Для фильтрации кремниевых наночастиц по размеру была задействована технология создания градиента плотностей с использованием центрифугирования. Следующим шагом были проверены оптические свойства синтезированных кремниевых наночастиц. Экспериментально измеренные спектры темнопольной микроскопии продемонстрировали такое же положение пиков электрического и магнитного диполей, что и в теоретических расчётах.

Также были проведены эксперименты in vitro по оценке выживаемости и захвату кремниевых наночастиц на клеточной линии B16-F10. Оценка выживаемости клеток и токсичности наночастиц была проведена посредством анализа Аламар Блю. В результате эксперимента было показано, что кремниевые наночастицы практически не оказывают токсического эффекта на клетки. Клеточная выживаемость даже при максимальном количестве частиц (500 мкг/мл, 20 мкл) превышала 90%. В свою очередь, для изучения захвата кремниевых наночастиц клетками носители были предварительно помечены помечены красителем Сy 5, конъюгированными с бычьим сывороточным альбумином BSA. Мембрана клеток была помечена красителем флуоресцеин. Захват кремниевых наночастиц изучали с помощью метода конфокальной лазерной микроскопии. Было доказано, что кремниевые наночастицы были успешно захвачены клетками.

Нагрев кремниевых наночастиц вне и внутри клеток изучался с помощью комбинационного рассеяния света по спектральному сдвигу стоксовой компоненты. Кремниевые наночастицы были облучены HeNe лазером с длиной волны 632.8 нм. Интенсивность лазерного излучения составляла примерно I0 ≈ 2 мВт/мкм2. Сдвиг стоксовой компоненты составлял для измерения вне клеток при максимальной мощности составил 4 см^(-1), что соответствует нагреву около 120 градусов. Однако при экспериментах внутри клеток сдвиг был менее, около 2 см^(-1), что соответствует нагреву в 70 градусов. Такого изменения температуры достаточно для терапии, потому что процесс апоптоза происходит примерно при 42 градусах Цельсия.

Также в работе было проверено и биораспределение полученных наночастиц in vivo. Частицы были модифицированы красителем Cy 5 и введены в опухоль лабораторной мыши. Затем через 1, 3 и 7 дней мыши были выведены из эксперимента. Распределение частиц было изучено как в основных органах, так и в самой опухоли. Эксперименты показали, что частицы были локализованы только в опухоли и не мигрировали в другие органы.

Таким образом, кремниевые наночастицы способны эффективно конвертировать лазерное излучение в тепло. Это дает возможность более локально повышать температуру частиц, не перегревая окружающие клетки и ткани за счет локального измерения температуры. В перспективе планируется провести терапию и измерение температуры в режиме реального времени на живой лабораторной мыши.



1. Peltek O.O. et al. Fluorescence-based thermometry for precise estimation of nanoparticle laser-induced heating in cancerous cells at nanoscale // Nanophotonics. De Gruyter Open Ltd, 2022. Vol. 11, № 18. P. 4323–4335.

2. Gerasimova E.N. et al. Real-Time Temperature Monitoring of Photoinduced Cargo Release inside Living Cells Using Hybrid Capsules Decorated with Gold Nanoparticles and Fluorescent Nanodiamonds // ACS Appl Mater Interfaces. American Chemical Society, 2021. Vol. 13, № 31. P. 36737–36746.

3. Dibaba S.T. et al. NIR Light-Degradable Antimony Nanoparticle-Based Drug-Delivery Nanosystem for Synergistic Chemo–Photothermal Therapy in Vitro // ACS Appl Mater Interfaces. American Chemical Society, 2019. Vol. 11, № 51. P. 48290–48299.

4. Quintanilla M. et al. Thermal monitoring during photothermia: Hybrid probes for simultaneous plasmonic heating and near-infrared optical nanothermometry // Theranostics. Ivyspring International Publisher, 2019. Vol. 9, № 24. P. 7298–7312.

5. Zograf G.P. et al. All-Optical Nanoscale Heating and Thermometry with Resonant Dielectric Nanoparticles for Controllable Drug Release in Living Cells // Laser Photon Rev. Wiley-VCH Verlag, 2020. Vol. 14, № 3. P. 1900082.

6. Zograf G.P. et al. Resonant Nonplasmonic Nanoparticles for Efficient Temperature-Feedback Optical Heating // Nano Lett. American Chemical Society, 2017. Vol. 17, № 5. P. 2945–2952.

In the Russian Federation, according to the Ministry of Health, about 10,000 new cases of melanoma are diagnosed every year. Modern methods of therapy for this disease are based either on surgery or on chemotherapy. However, these methods are associated with numerous side effects and can be ineffective. An alternative to these methods of treatment can be photothermal therapy.[1] The idea of this approach includes the nanoparticles accumulation in the tumor zone and their subsequent irradiation by laser radiation for heating. However, excessive temperature changes strongly affect cellular functions such as cell division, gene expression, growth factor activity, and metabolism.[2] Thus, real-time temperature monitoring during external heating is necessary to predict cell behavior, and to prevent possible side effects during therapy. [3, 4]

One of the most used methods of temperature monitoring is Raman stokes spectral shifts, for example, from silicon nanoparticles. They can convert laser radiation into thermal energy. [5,6] Also, such dielectric nanoparticles possess optically induced magnetic and electric Mie resonances, which allows them to amplify the Raman scattering signal, absorb light and stimulate optical heating. All the advantages of silicon nanoparticles make these carriers perspective for oncotherapy without side effects due to temperature control.

First, the diameter of silicon particles for the most effective heating was theoretically calculated, and it was equal to 180 nm. Then silicon particles were synthesized by laser ablation in a liquid. A silicon wafer was used as a substrate, and the ablation was carried out in water. To filter silicon nanoparticles by size, the technology of density gradient centrifugation was used. The next step was to test the optical properties of synthesized silicon nanoparticles. Experimentally measured dark-field scattering spectra showed the resonant nature of nanoparticles.

Further, in vitro experiments were also conducted to evaluate the cell viability and uptake of nanoparticles by the B16-F10 cell line. The cell viability was analyzed using the Alamar Blue test. As a result, it was shown that silicon nanoparticles have almost no toxic effect on cells and cell viability exceeded 90% even with the maximum number of particles (500 mcg/ml, 20 mсl). In turn, to study the uptake of silicon nanoparticles by cells, the carriers were modified with a Cy 5 dye conjugated with bovine serum albumin. The cell membrane was labeled with the Fluorescein dye. The uptake of silicon nanoparticles was studied using confocal laser microscopy. It has been demonstrated that silicon nanoparticles have been successfully uptaken by cells.

The heating of silicon nanoparticles outside and inside cells was studied using Raman stokes spectral shifts. For this, silicon nanoparticles were irradiated with a He Ne laser with a wavelength of 632.8 nm. The power density of the laser radiation was approximately I0 = 2 MW/m2. Raman stokes spectral shift for measurement outside the cells at maximum power was equal to 4 cm-1, which corresponds to a heating of about 120 degrees. However, the shift inside cells was less, about 2 cm-1, which corresponds to a heating of 70 degrees. Such a change in temperature is sufficient for therapy because the process of apoptosis occurs at about 42 degrees Celsius.

Then the biodistribution of the silicon nanoparticles was tested in vivo. The particles were modified with Cy 5 dye and injected locally into the tumor of a laboratory mouse. Then, after 1, 3 and 7 days, the mice were sacrificed, then main organs and the tumor were taken from the body. The biodistribution experiments showed that the particles were localized only in the tumor and did not migrate to other organs.

Thus, silicon nanoparticles can efficiently convert laser radiation into heat. They can be used to avoid overheating of the surrounding cells and tissues due to real time temperature monitoring. In the future, it is planned to perform photothermal therapy and temperature measurement in real time simultaneously on a living laboratory mouse.





References:

1. Peltek O.O. et al. Fluorescence-based thermometry for precise estimation of nanoparticle laser-induced heating in cancerous cells at nanoscale // Nanophotonics. De Gruyter Open Ltd, 2022. Vol. 11, № 18. P. 4323–4335.

2. Gerasimova E.N. et al. Real-Time Temperature Monitoring of Photoinduced Cargo Release inside Living Cells Using Hybrid Capsules Decorated with Gold Nanoparticles and Fluorescent Nanodiamonds // ACS Appl Mater Interfaces. American Chemical Society, 2021. Vol. 13, № 31. P. 36737–36746.

3. Dibaba S.T. et al. NIR Light-Degradable Antimony Nanoparticle-Based Drug-Delivery Nanosystem for Synergistic Chemo–Photothermal Therapy in Vitro // ACS Appl Mater Interfaces. American Chemical Society, 2019. Vol. 11, № 51. P. 48290–48299.

4. Quintanilla M. et al. Thermal monitoring during photothermia: Hybrid probes for simultaneous plasmonic heating and near-infrared optical nanothermometry // Theranostics. Ivyspring International Publisher, 2019. Vol. 9, № 24. P. 7298–7312.

5. Zograf G.P. et al. All-Optical Nanoscale Heating and Thermometry with Resonant Dielectric Nanoparticles for Controllable Drug Release in Living Cells // Laser Photon Rev. Wiley-VCH Verlag, 2020. Vol. 14, № 3. P. 1900082.

6. Zograf G.P. et al. Resonant Nonplasmonic Nanoparticles for Efficient Temperature-Feedback Optical Heating // Nano Lett. American Chemical Society, 2017. Vol. 17, № 5. P. 2945–2952.