Доклад посвящен применению фемтосекундного импульсного лазерного излучения для исследования быстропротекающих биофизических процессов в реакционных центрах фотосинтеза, для 2D и 3D химического картирования биологических клеток и тканей методами фемтосекундной рамановской микроскопии-спектроскопии и для фемтосекундной лазерной нанохирургии клеток, эмбрионов и биологических тканей.

Применение фемтосекундной лазерной спектроскопии к исследованию фотосистем ФС I и ФС II содержащих молекулы хлорофилла Chl d, Chl f позволило выявить новые особенности в механизме и кинетике преобразования кванта света в химически активные ион-радикальные состояния. Спектральные особенности Chl d и Chl f существенно отличные от Chl a, а также известные структурные данные о сайтах локализации Chl d и Chl f в фотосистемах позволили определить кинетику и последовательность элементарных актов переноса энергии и электрона в фотосистемах ФС I и ФС II.

Специфика фемтосекундных лазерных импульсов заключается в их высокой пиковой интенсивности и большой спектральной ширине. Первое обстоятельство позволяет эффективно наблюдать нелинейные оптические процессы, в т.ч. высоконаправленные когерентные процессы рамановского рассеяния: CARS (Coherent anti-Stokes Raman scattering), SRS (Stimulated Raman scattering). Второе обстоятельство позволяет единовременно получать спектральный диапазон колебательных частот образца в сотни обратных сантиметров. По сравнению с традиционными рамановскими микроскопами использование созданного в ФИЦ ХФ РАН уникального фемтосекундного микроспектрометра имеет преимущества для следующих задач:

• В задачах где необходимо иметь максимально возможное пространственное разрешение при сканировании образца (до 200 нм). Такое разрешение достигается за счет нелинейности генерируемых оптических процессов в исследуемом образце.

• В задачах где определение рамановских частот в стоксовой области сильно затруднено. В этом случае в фемтосекундном микроспектрометре сигнал собирается из антистоксовой области (CARS), свободной от люминесценции образца.

• В задачах где необходимо максимально быстрое 2D/3D картирование в узком диапазоне колебательных частот (~10 1/см). Увеличение скорости сканирования до 3х порядков достигается за счет использования быстрых гальванических зеркал и ФЭУ. Данная конфигурация особенно подходит для тех образцов где нежелательны механические перемещения исследуемого образца. Для образцов с низкими концентрациями веществ или слабыми интенсивностями рамановских линий может быть использована спектральная фокусировка лазерных импульсов. А этом случае, сканируемый интервал колебательных частот может быть уменьшен до 2-3 1/см.

• В задачах, где необходимо быстрое 2D/3D картирование заданного диапазона колебательных частот (шириной до 1200 1/см) со спектральным разрешением 10 1/см. Скорость сканирования в десятки раз выше, чем в традиционных рамановских микроскопах.



Методика была апробирована в исследованиях:

• GFP белков, родопсинах, ксантофиллах, липидно-белковых смесях, пигмент-белковых комплексах (в т.ч. хлорофилл содержащих), оммохромах беспозвоночных.;

• Клеточных культур, срезах тканей животных и человека (печени, мозга, жировой ткани, липидные капли, липофусциновые гранулы).

• Живых биологических объектов: ооцитов, сперматозоидов, стволовых клеток.

Использование остросфокусированных фемтосекундных лазерных импульсов позволяет создавать микро- и наноразрезы в биологическом материале без теплового разогрева. Фемтосекундный лазер ближнего ИК диапазона; непрерывные лазеры видимого и ближнего ИК диапазона; оптический микроскоп с моторизованной 2D платформой; пространственные световые модуляторы света (SLM) позволяют проводить малоинвазивные микро- и нанохирургических операции, манипуляций с отдельными клетками, эмбрионами и тканями. Совместное использование непрерывного лазера и SLM позволяет получать сложные распределения электромагнитных полей в объеме образца, например, создавать множественные независимые лазерные фокусы. В частности, каждый из таких лазерных фокусов может представлять из себя оптическую ловушку для клеток или органелл клетки. При надлежащем выборе параметров эксперимента можно осуществлять удерживание, вращение или независимое перемещение данных объектов, в т.ч. растаскивание или сближение нескольких объектов одновременно (оптический мультиплексор). Это дает богатую информацию о силах между органеллами, упругих свойствах биологических образцов. Данная установка позволяет решать задачи:

• Лазерная диссекция тканей и клеток.

• Оптическая трансфекция (введение внешнего генетического материала в клетки через созданные в клеточной мембране каналы).

• Искусственное лазерное слияние двух или более клеток.

• Лазерная инактивация хромосом клетки.

• Терапевтическое лазерное клонирование.

• Изучение упругих свойств биообъектов на разных этапах развития; сил взаимодействия между отдельными частями биологической системы (органеллами, органеллами и мембранами и др.).

Развита принципиально новая технология и разработано необходимое материально-техническое оснащение для проведения минимально инвазивной нанохирургии эмбрионов млекопитающих с использованием лазеров с излучением в окне прозрачности биологической ткани. Разработана технология перспективна для получения генетически модифицированных доимплантационных эмбрионов млекопитающих.

The report is devoted to the applications of femtosecond pulsed laser for studying ultrafast biophysical processes in photosynthesis reaction centers, for 2D and 3D chemical mapping of biological cells and tissues using femtosecond Raman microscopy-spectroscopy, as well as for femtosecond laser nanosurgery of cells, embryos and biological tissues.

The application of femtosecond laser spectroscopy to the study of PS I and PS II photosystems containing Chl d, Chl f chlorophyll molecules made it possible to reveal new features in the mechanism and kinetics of light quantum transformation into chemically active radical ion states. The spectral features of Chl d and Chl f, which differ significantly from Chl a, as well as the known structural data on the localization of Chl d and Chl f in photosystems, made it possible to determine the kinetics and sequence of elementary acts of energy and electron transfer in PS I and PS II photosystems.

A feature of femtosecond laser pulses is their high peak intensity and large spectral width. The first circumstance makes it possible to effectively observe nonlinear optical processes, incl. processes of highly directed coherent Raman scattering: CARS (coherent anti-Stokes Raman scattering), SRS (stimulated Raman scattering). The second circumstance makes it possible to simultaneously obtain a spectral range of sample vibration frequencies of hundreds of reciprocal centimeters. Compared to traditional Raman microscopes, the use of a unique femtosecond microspectrometer developed at the FRC CF RAS has advantages for solving the following problems:

• In tasks where it is necessary to have the highest possible spatial resolution when scanning a sample (up to 200 nm). This resolution is achieved due to the nonlinearity of the generated optical processes in the sample under study.

• In problems where the determination of combination frequencies in the Stokes region is very difficult. In this case, in a femtosecond microscope-spectrometer, the signal is taken from the anti-Stokes region (CARS), which is free from sample luminescence.

• In tasks where the fastest possible 2D/3D display is required in a narrow range of vibration frequencies (~10 1/cm). An increase in the scanning speed up to 3 orders of magnitude is achieved through the use of high-speed galvanic mirrors and PMTs. This configuration is particularly suitable for specimens where mechanical movement of the test specimen is undesirable. Spectral focusing of laser pulses can be used for samples with low concentrations of substances or low intensity of Raman lines. In this case, the scanned range of oscillation frequencies can be reduced to 2-3 1/cm.

• In tasks where fast 2D/3D mapping of a given range of vibrational frequencies (up to 1200 1/cm wide) with a spectral resolution of 10 1/cm is required. The scanning speed is ten times higher than in traditional Raman microscopes.

The technique has been tested in studies:

• GFP proteins, rhodopsins, xanthophylls, lipid-protein mixtures, pigment-protein complexes (including chlorophyll-containing), invertebrate ommochromes.;

• Cell cultures, tissue sections of animals and humans (liver, brain, adipose tissue, lipid drops, lipofuscin granules).

• Living biological objects: oocytes, spermatozoa, stem cells.



The use of highly focused femtosecond laser pulses makes it possible to create micro- and nanocuts in biological material without thermal heating. femtosecond laser in the near infrared range; cw lasers in the visible and near infrared ranges; optical microscope with a motorized 2D platform; spatial light modulators (SLMs) allow for minimally invasive micro- and nanosurgical operations, manipulations with individual cells, embryos and tissues. The combined use of a continuous-wave laser and SLM makes it possible to obtain complex distributions of electromagnetic fields in the sample volume, for example, to create multiple independent laser foci. In particular, each of these laser foci can be an optical trap for cells or cell organelles. With the right choice of experiment parameters, it is possible to hold, rotate or independently move these objects, incl. disconnection or connection of several objects at the same time (optical multiplexer). This provides rich information about the forces between organelles, the elastic properties of biological samples. This installation allows you to solve the following tasks:

• Laser dissection of tissues and cells.

• Optical transfection (introduction of external genetic material into cells through channels created in the cell membrane).

• Artificial laser fusion of two or more cells.

• Laser inactivation of cell chromosomes.

• Therapeutic laser cloning.

• Study of the elastic properties of biological objects at different stages of development; interaction forces between individual parts of a biological system (organelles, organelles and membranes, etc.).

A fundamentally new technology has been developed and the necessary material and technical equipment has been developed for minimally invasive nanosurgery of mammalian embryos using lasers with radiation in the transparency window of biological tissue. A promising technology has been developed for obtaining genetically modified preimplantation mammalian embryos.