Поддержание гомеостаза животного организма остается одним из наиболее эффективных методов предупреждения развития ряда опасных заболеваний неинфекционной и инфекционной природы. Поиск новых высокоэффективных и безопасных радикал-нейтрализующих систем продолжается, и обусловлен тем, что в больших концентрациях или вследствие своей чрезмерной реактивности, известные органические антиоксиданты индуцируют свободно-радикальные реакции, проявляя при этом, прооксидантные свойства. С этой точки зрения особое внимание привлекает использование в качестве потенциальных антиоксидантов - наночастиц, в частности наночастиц серебра (Ag(0)НЧ), характеризующихся высокой величиной поверхности раздела фаз, а соответственно и избытком поверхностной энергии, следствием чего является проявление нанообъектами высокой физико-химической активности сочетающейся с их крайне низкой токсичностью. Совмещение антимикробных свойств Ag(0)НЧ с их антиоксидантными свойствами, а также водорастворимостью и биосовместимостью стабилизирующего их полисахарида арабиногалактана (Ар-Гал) позволит разработать современные наноматериалы для борьбы, как с инфекционными агентами, так и для нивелирования последствий избыточной генерации свободных радикалов в условиях естественного иммунного ответа организма. Тогда как выявление потенциальных механизмов антирадикального действия наночастиц, в том числе высоко-чувствительным хемилюминесцентным методом позволит направленно варьировать его выраженность посредством изменения их характеристик [1].

Данная работа направлена на синтез и хемилюминесцентную диагностику радикал-связывающей способности Ар-Гал-стабилизированных Ag(0)НЧ.

Синтез водорастворимых органо-неорганических нанокомпозитов представляющих собой Ар-Гал-стабилизированные Ag(0)НЧ осуществляли восстановлением нитрата серебра в водном растворе Ар-Гал, выполняющего одновременно функцию и восстановителя ионов серебра до Ag0 и стабилизатора образующихся наночастиц. Реакцию инициировали повышением рН реакционной среды до 10-11 и температуры до 60 С°. Время синтеза составляло от 10 до 50 минут в зависимости от количества вводимого серебра, варьирование которого осуществляли изменением соотношения катионы Ag/Ар-Гал от 0.005 до 0.05. Фазовый анализ нанокомпозитов выполнен на основании дифрактограмм характеризующихся наличием интенсивных рефлексов в области 38.1, 44.2 и 64.3 2θ ° соответствующих (111), (200) и (220) плоскостям кристаллической решетки Ag(0). Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии и рентгенофазового анализа нанокомпозиты формируются в виде распределенных в полисахаридной матрице Ар-Гал частиц с формой приближенной к сферической и средним размером нанокристаллитов Ag(0) 3.0 нм, 3.5 нм, 4.0 нм и 5 нм для образцов содержащих 0.5 %, 1.0 %, 1.9 % и 3.6 % Ag соответственно.

С использованием известной радикал-генерирующей системы «пероксидаза хрена - H2O2» с люминолом в качестве активатора хемилюминесценции, а также посредством обработки полученных кинетических кривых хемилюминесценции методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) нами охарактеризованы антиоксидантные свойства полученных серебро-содержащих нанокомпозитов. Установлено, что их введение в радикал-генерирующую систему «пероксидаза хрена - H2O2» сопровождается выраженным тушением хемилюминесценции, сопоставимым по значению степени тушения (q) с q стандартного антиоксиданта – аскорбиновой кислоты. При этом, значение q находится в зависимости как от концентрации водных растворов нанокомпозитов, варьируя в диапазоне 0.19-0.98, так и от количественного содержания наночастиц серебра в составе композита. При этом изучение кинетики хемилюминесценции в присутствии нанокомпозитов позволило установить, что в низких концентрациях (0.1-0.4 мг/мл) их водных растворов тушение хемилюминесценции идентифицируется исключительно снижением интенсивности плато, тогда как увеличение концентрации водных растворов нанокомпозитов до 2.5-5.0 мг/мл сопровождается частичным снижением интенсивности хемилюминесценции на начальном этапе (0-6 мин) с последующим медленным нарастанием интенсивности свечения до уровня контроля [2]. Полученные данные свидетельствуют о концентрационно-обусловленной зависимости действия полисахарид-стабилизированных Ag(0)НЧ, в частности в низких концентрациях они проявляют себя как типичные слабые антиоксиданты, тогда как при высоких концентрациях как антиоксиданты средней силы.

Таким образом нами получен ряд водорастворимых нанокомпозитов представляющих собой полисахарид-стабилизированные Ag(0)НЧ со средним размером варьирующим в интервале 3.0-5.0 нм. С привлечением метода активированной хемилюминесценции впервые выполнена количественная оценка антиоксидантных свойств полисахарид-стабилизированных Ag(0)НЧ, а также установлена выраженная зависимость значения q от концентрации их водных растворов и процентного содержания серебра в составе композита.



Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-26-00140).



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Iu.A. Vladimirov, E.V. Proskurina, D.Iu. Izmailov. Biofizika. 56 (6): 1081 (2011)

2. S. Guo, Q. Deng, J. Xiao, B. Xie, Z. Sun, J. Agric. Food. Chem. 55 (8), 3134 (2007).

Supporting homeostasis is one of the most effective methods of preventing the development of a number of dangerous diseases of non-infectious and infectious nature. The search for new highly effective and harmless radical-neutralizing systems continues, and is due to the fact that in high concentrations or due to their excessive reactivity, known organic antioxidants induce free-radical reactions, exhibiting pro-oxidant properties. In this regard, the use of nanoparticles, in particular silver nanoparticles (Ag(0)NP), as potential antioxidants attracts particular attention. Due to their small size and high value of the interphase surface and, consequently, the excess surface energy, nanoparticles are characterized by high physical and chemical activity combined with their extremely low toxicity. Combining the antimicrobial properties of Ag(0)NPs with their antioxidant properties, as well as the water-solubility and biocompatibility of their stabilizing polysaccharide arabinogalactan (Ar-Gal), will allows the development of modern nanomaterials to combat both infectious agents and to neutralize the effects of excess free radical generation in the conditions of the natural immune response. Whereas the determination of potential mechanisms of the antiradical action of nanoparticles, including highly sensitive chemiluminescent method, will be possible to vary its expression by changing their characteristics [1].

This work is aimed at the synthesis and chemiluminescence analysis of the radical-scavenging capacity of Ar-Gal-stabilized Ag(0)NPs.

Synthesis of water-soluble organic-inorganic nanocomposites consisting of Ar-Gal-stabilized Ag(0)NPs was carried out by reduction of silver nitrate in an aqueous solution of Ar-Gal, which simultaneously serves as a silver ion reductant to Ag(0) and stabilizer of the formed nanoparticles. The reaction was initiated by increasing the pH of the reaction medium to 10-11 and the temperature to 60 C°. The synthesis time ranged from 10 to 50 minutes depending on the amount of silver introduced, which was varied by changing the cations Ag/Ar-Gal ratio from 0.005 to 0.05. The phase analysis of the nanocomposites was performed on the basis of diffractograms characterized by the presence of intense reflexes in the region of 38.1, 44.2 and 64.3 2θ ° corresponding to (111), (200) and (220) planes of the Ag(0) crystal lattice. According to the data of transmission electron microscopy and X-ray phase analysis, nanocomposites are formed in the form of particles distributed in the Ar-Gal polysaccharide matrix with the shape similar to spherical and the average size of Ag(0) nanocrystallites 3.0 nm, 3.5 nm, 4.0 nm and 5 nm for samples containing 0.5 %, 1.0 %, 1.9 % and 3.6 % Ag respectively.

Using the well-known radical generating system "horseradish peroxidase - H2O2" with luminol as a chemiluminescence activator, as well as by processing the obtained kinetic curves of chemiluminescence by TAR (Total Antioxidant Reactivity) we characterized the antioxidant properties of silver-containing nanocomposites.It was found that their introduction into the radical generating system "horseradish peroxidase - H2O2" is accompanied by a pronounced quenching of chemiluminescence, comparable to the value of the quenching degree (q) with q of the standard antioxidant - ascorbic acid. In this case, the value of q depends on both the concentration of aqueous solutions of nanocomposites, varying in the range of 0.19-0.98, and the quantitative content of silver nanoparticles in the composition of the composite.

Study of chemiluminescence kinetics in the presence of nanocomposites showed that in low concentrations (0.1-0.4 mg/ml) of their aqueous solutions chemiluminescence quenching is identified exclusively by plateau intensity reduction. Whereas increasing the concentration of nanocomposite aqueous solutions up to 2.5-5.0 mg/ml is accompanied by a partial decrease of the chemiluminescence intensity at the initial stage (0-6 min) with subsequent slow increase of the luminescence intensity to the control level [2]. Our data demonstrate a concentration-dependence of the action of polysaccharide-stabilized Ag(0)NPs, in particular, at low concentrations they exhibit themselves as typical weak antioxidants, whereas at high concentrations they are medium strong antioxidants.

Thus, we obtained a number of water-soluble nanocomposites consisting of polysaccharide-stabilized Ag(0)NPs with an average size varying in the range of 3.0-5.0 nm. Using the method of activated chemiluminescence for the first time quantitative assessment of antioxidant properties of polysaccharide-stabilized Ag(0)NPs was performed, and also a pronounced dependence of q value on the concentration of their aqueous solutions and the percentage of silver in the composition of the composite was determined.



ACKNOWLEDGMENTS

This work was financially supported by the Russian Science Foundation (grant № 23-26-00140).



REFERENCES

1. Iu.A. Vladimirov, E.V. Proskurina, D.Iu. Izmailov. Biofizika. 56 (6): 1081 (2011)

2. S. Guo, Q. Deng, J. Xiao, B. Xie, Z. Sun, J. Agric. Food. Chem. 55 (8), 3134 (2007).