Исследование локальных концентраций кислорода в клетках и тканях представляет большой интерес для многих областей физиологии и медицины, включая онкологию. Перспективным оптическим методом для оценки содержания кислорода в клетках и тканях в режиме реального времени является фосфоресцентный имиджинг с временным разрешением PLIM (Phosphorescence lifetime imaging). На данный момент актуальной задачей является поиск новых фосфоресцентных сенсоров, имеющих высокую чувствительность к кислороду, способных эффективно накапливаться в клетках и тканях и не имеющих выраженной токсичности.

Целью исследования являлась оценка возможности использования новых фосфоресцентных сенсоров в опухолевых клетках в качестве сенсоров молекулярного кислорода.

В работе были исследованы водорастворимые металлорганические комплексы на основе Ir(III): Ir-1, Ir-2, Ir-2a, Ir-3 и Ir-4. Тестирование комплексов проводили на опухолевых клетках колоректального рака мыши – СТ26. Цитотоксичность комплексов оценивали методом МТТ-теста. Анализ динамики проникновения комплексов в опухолевые клетки in vitro осуществляли в интервале от 1 до 6 ч. Субклеточное распределение оценивали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) при возбуждении на длине волны 543 нм, с мощностью лазера 8 мВт. Сигнал комплекса детектировали в диапазоне 650 – 750 нм. Методом PLIM проведена оценка времени жизни фосфоресценции комплексов в опухолевых клетках СТ26 в условиях гипоксии и нормоксии. Возбуждение комплексов осуществляли в двухфотонном режиме на длине волны 760 нм, детекция сигнала осуществлялась в диапазоне 596 – 660 нм.

По результатам МТТ-тест установлено, что комплексы Ir-2, Ir-3 и Ir-4 являются наименее токсичными. Через 24 часа инкубации клеток СТ26 с комплексами процент жизнеспособных клеток при концентрации комплексов 125 мкМоль составил 87.9 ± 4.5 %, 94.6 ± 0.5 % и 92.5 ± 2.7 %, соответственно. Для комплекса Ir-2a при концентрации 75 мкМ процент жизнеспособных клеток составил 83.2 ± 6.5 %. Комплекс Ir-1 проявляет наибольшую цитотоксичность из исследуемых комплексов, IC50 составила 50 мкМоль. Дальнейшие исследования in vitro проводили на комплексах Ir-2, Ir-2a, Ir-3 и Ir-4, обладающих наименьшей токсичностью и хорошей водорастворимостью. Методом лазерной сканирующей микроскопии установлено, что фосфоресцентные комплексы Ir-2 и Ir-2a проникают в живые опухолевые клетки. Интенсивность люминесценции комплексов в опухолевых клетках увеличивается в период от 1 до 6 часов, что свидетельствует о повышении концентрации комплексов в живых опухолевых клетках. Исследование внутриклеточной локализации комплексов показало, что комплексы равномерно распределяются в цитоплазме клеток, не проникают в клеточное ядро. Методом PLIM были зафиксированы вариации времен жизни фосфоресценции в опухолевых клетках при моделировании гикпоксии. Время жизни фосфоресценции для комплекса Ir-2 в условиях нормоксии составило 1.48 ± 0.05 мкс, в условиях гипоксии – 2.42 ± 0.09 мкс, для комплекса Ir-2a в условиях нормоксии – 1.04 ± 0.16 мкс, в условиях гипоксии – 1.94 ± 0.32 мкс. Таким образом, время жизни фосфоресценции комплексов Ir-2 и Ir-2a в условиях нормоксии уменьшилось в 1.6 раз и 1.8 раз соответственно, следовательно, комплексы обладают чувствительностью к кислороду.

По полученным результатам исследования можно заключить, что комплексы Ir-2 и Ir-2a являются наиболее перспективными для дальнейших исследований in vivo, и могут быть применены в качестве сенсоров молекулярного кислорода.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, проект № 18-73-10021.

The study of local oxygen concentrations in cells and tissues is of great interest for many areas of physiology and medicine, including oncology. Phosphorescence lifetime imaging (PLIM) is a promising optical method for assessing the oxygen content in cells and tissues in real time. At the moment, an urgent task is to search for new phosphorescent sensors that have a high sensitivity to oxygen, effectively accumulate in cells and tissues and don’t have pronounced toxicity.

The aim of the study was to evaluate the possibility of using new phosphorescent sensors in tumor cells as molecular oxygen sensors.

Water-soluble organometallic complexes based on Ir(III): Ir-1, Ir-2, Ir-2a, Ir-3, and Ir-4 were studied in this work. The complexes were tested on CT26 mouse colorectal cancer cells. The cytotoxicity of the complexes was assessed by the MTT assay. Analysis of the dynamics of the penetration of complexes into tumor cells in vitro was carried out in the range from 1 to 6 hours. Subcellular distribution was assessed using a laser scanning microscope LSM 880 (Carl Zeiss, Germany) with excitation at a wavelength of 543 nm, with a laser power of 8 mW. The signal of the complex was detected in the range of 650 – 750 nm. The PLIM method was used to assessment the phosphorescence lifetime of complexes in CT26 tumor cells under hypoxic conditions. The complexes were excited in the two-photon mode at a wavelength of 760 nm, and the signal was detected in the range of 596–660 nm. The complexes were excited in the two-photon mode at a wavelength of 760 nm, and the signal was detected in the range of 596–660 nm.

According to the results of the MTT assay, it was found that the complexes Ir-2, Ir-3 and Ir-4 don’t exhibit pronounced cytotoxicity. After 24 hours of incubation of CT26 cells with complexes, the percentage of viable cells at a complex concentration of 125 µM was 87.9 ± 4.5 %, 94.6 ± 0.5 %, and 92.5 ± 2.7 %, respectively. For the Ir-2a complex at a concentration of 75 μM, the percentage of viable cells was 83.2 ± 6.5%. The Ir-1 complex exhibits cytotoxicity; the Half-maximal inhibitory concentration (IC50) of the Ir-1 was 50 μM. Further in vitro studies were carried out on Ir-2, Ir-2a, Ir-3 and Ir-4 complexes, which do not exhibit cytotoxicity and are soluble in water. Using laser scanning microscopy, it was found that the phosphorescent complexes Ir-2 and Ir-2a penetrate into living tumor cells. The intensity of the luminescence of complexes in tumor cells increases in the period from 1 to 6 hours, which indicates an increase in the concentration of complexes in living tumor cells. The study of the intracellular localization of the complexes showed that the complexes are evenly distributed in the cytoplasm of cells and do not penetrate into the cell nucleus. The PLIM method recorded variations in the phosphorescence lifetime in tumor cells in the simulation of hypoxia. The phosphorescence lifetime for the Ir-2 complex under normoxic conditions was 1.48 ± 0.05 µs, under hypoxic conditions, 2.42 ± 0.09 µs, for the Ir-2a complex under normoxic conditions, 1.04 ± 0.16 µs, and under hypoxic conditions, 1.94 ± 0.32 µs. Thus, the phosphorescence lifetime of the Ir-2 and Ir-2a complexes under normoxic conditions decreased by factors of 1.6 and 1.8, respectively; therefore, the complexes are sensitive to oxygen.

Based on the results of the study, it can be concluded that Ir-2 and Ir-2a complexes are the most promising for further in vivo studies and can be used as molecular oxygen sensors.

This work was supported by the Russian Science Foundation, project 18-73-10021.