Коллективом авторов разработана оригинальная методика разрушения генетического материала (энуклеация) в ооцитах при помощи остросфокусированного фемтосекундного лазерного излучения с длиной волны 795 нм. Энуклеация ооцитов обычно осуществляется при помощи микроманипулятора и подразумевает прокалывание ооцита и высасывание части цитоплазмы, содержащей метафазную пластинку. Так получают энуклеированные ооциты (реципиентный цитопласт), который необходим для решения задачи клонирования животных и метода цитоплазматической замены у человека. Удаление из ооцита небольшого объема цитоплазмы, содержащей метафазную пластинку, может существенно повлиять на дальнейшее развитие, так как именно в этой области содержатся репрограммирующие факторы, такие как MPF, ORF1 и soronin. Преимущество лазера перед традиционным методом энуклеации – в возможности локализовать воздействие строго в области метафазной пластинки и избежать потери репрограммирующих факторов.

Ранее мы показали, что энуклеацию ооцитов мыши при помощи фемтосекундного лазерного излучения можно совершать с высокой точностью и малой инвазивностью (Osychenko A.A. et.al, Biomedical Optics Express, 2022). Для дальнейшего развития методики фемтосекундной лазерной энуклеации мы испытали различные параметры лазерного воздействия для определения диапазона неинвазивного воздействия на ооциты, а так же исследовали цитотоксический эффект фемтосекундного лазерного излучения.

Исследован диапазон параметров фемтосекундного лазерного излучения для осуществления локальной деструкции генетического материала ооцита мыши. Работа выполнена в режиме частоты повторения фемтосекундных импульсов 80 МГц, 1 кГц, 10 кГц и 100 кГц. Исследована эффективность проведения процедуры энуклеации ооцита мыши в зависимости от длины волны фемтосекундного лазерного излучения, энергии импульса, длительности цуга импульсов. Обнаружены ограничения диапазона параметров по энергии импульса и по длительности цугов, обусловленные скоростью проведения процедуры и частотой образования нежелательных паро-газовых пузырей.

Исследовано цитотоксическое действие процедуры фемтосекундной лазерной энуклеации методами флуоресцентной микроскопии. Было измерено время жизни флуоресценции NADH методом FLIM (Fluorescence-lifetime imaging microscopy) в ооцитах, облученных и не облученных (контрольных) фемтосекундным лазерным излучением. Полученные измерения указывает на приблизительно равный вклад в метаболизм ооцитов связанной и не связанной формы NADH, это соотношение не зависит от наличия или отсутствия облучения лазером, а так же не меняется существенно при наличии/отсутствии партеногенетической активации.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 21-75-10155. Работа выполнена на ЦКП № 506694 ФИЦ ХФ РАН и УНУ № 1440743.

The authors have developed an original method of the genetic material destruction (enucleation) by the tightly-focused 795 nm femtosecond laser radiation. Ordinary, oocytes are enucleated by the microneedle through the aspiration of the metaphase plate within a small amount of the surrounding cytoplasm. This is the way of enucleated oocytes (recipient cytoplast) obtainment. Recipient cytoplast is required for animal cloning and mitochondrial replacement therapy in humans. The loss of this particular portion of the cytoplasm containing metaphase plate may affect the development, because exactly in this place some reprogramming factors are concentrated, for example, MPF, ORF1 and soronin. An advantage of the laser is an ability to localize the impact exactly in the area of metaphase plate and to avoid losing of reprogramming factors.

We have shown before that we are able to perform the femtosecond laser enucleation of the oocytes with a perfect preciseness and low invasiveness (Osychenko A.A. et.al, Biomedical Optics Express, 2022). To develop our technique, we tried different laser parameters for determination of non-invasive diapason of oocyte enucleation. More, we studied the cytotoxic effect of the femtosecond laser exposure.

The range of femtosecond laser radiation parameters for local destruction of the mouse oocyte genetic material has been studied. In this work we applied the femtosecond pulse repetition rate mode of 80 MHz, 1 kHz, 10 kHz, and 100 kHz. The efficiency of the mouse oocyte enucleation was studied depending on the wavelength of femtosecond laser radiation, pulse energy, and pulse train duration. Limitations of the range of parameters in terms of the pulse energy and the duration of the trains were found, due to the speed of the procedure and the frequency of formation of unwanted vapor-gas bubbles.

The cytotoxic effect of the femtosecond laser enucleation procedure was studied by fluorescent microscopy. The fluorescence lifetime of NADH was measured by FLIM (Fluorescence-lifetime imaging microscopy) in oocytes irradiated and not irradiated (control) with femtosecond laser radiation. The results indicate an approximately equal contribution of the bound and unbound forms of NADH to the metabolism of oocytes, this ratio does not depend on the presence or absence of laser irradiation, and also does not change significantly in the presence/absence of parthenogenetic activation.

This work is supported by the Russian Science Foundation under grant № 21-75-10155. The work was performed on the facilities of ACBS Center of the Collective Equipment (№ 506694, FRCCP RAS) and large-scale research facilities № 1440743