Флуоресценция триптофанилов в составе белков широко используется в качестве природного индикатора их внутримолекулярной конформационной динамики, тесно связанной с функциональной активностью, в частности, при изменении температуры. Источником информации о характере внутримолекулярной динамики ближайшего окружения возбужденной молекулы триптофана (Trp) являются температурные зависимости положения спектров и длительности флуоресценции Trp. Кинетика затухания флуоресценции Trp и в растворе, и в составе полипептидов многокомпонентна. В зависимости от типа растворителя, pH, регистрируют 2-3 компоненты флуоресценции с временами от сотен пикосекунд до ~ 10 нс. Характер внутримолекулярной микроконформационной динамики водно-белковой среды, влияющей на функциональную активность, во многом определяется состоянием системы водородных связей макромолекулы. Определенная информация для понимания механизмов происходящих при этом процессов может быть получена, в том числе, путем сравнительного анализа температурных зависимостей параметров флуоресценции триптофана в растворе и в составе белка.

Известно, что в окружении молекулы триптофана в водной среде образуется упорядоченная система водородных связей, имеющая вид цвиттерионного комплекса, которая оказывает существенное влияние на динамику возбуждений молекулы Trp. В работе было детально исследовано изменение спектральных и кинетических параметров, описывающих процессы затухания флуоресценции триптофана в водной среде при импульсном фотовозбуждении в зависимости от температуры в диапазоне -170°C ÷ +20°C. Предложена модель и проведен количественный анализ скоростей прямых и обратных электронных переходов в молекуле триптофана из возбужденного состояния в основное состояние и в состояние с переносом заряда (CTS). Исходя из полученных в работе экспериментальных и теоретических данных были выделены три области в спектре флуоресценции Trp: коротковолновая область (300 нм<l<386 нм), промежуточная область (386 нм <l< 400 нм) и длинноволновая область (400 нм<l<470 нм), для которых температурная зависимость скорости образования CTS имеет различный характер. Показана ключевая роль структурных перестроек в системе водородных связей, определяющих нелинейный характер изменения параметров флуоресценции триптофана в выделенных спектральных областях

Выявленный нелинейный характер зависимости времени затухания быстрых (t1, единицы нс) и медленных (t2, около 10 нс) компонент флуоресценции водного раствора молекул триптофана от температуры объяснен возникновением дополнительного канала дезактивации Trp* - переносом электрона от индольной части молекулы триптофана на водородные связи водного окружения и затем на ее амидные группы. В результате образуется состояние с переносом заряда Trp+R-. Дезактивация этого CTS происходит как в результате обратного перехода из данного состояния в возбужденное состояние Trp, так и за счет либо флуоресценции, либо в процессе тепловой релаксации в основное состояние.

Использованный в работе спектрально-динамический подход при исследовании температурных зависимостей скоростей дезактивации возбужденных состояний Trp позволил также обнаружить возникновение конформационных (фазовых) переходов в системе водородных связей в окружении Trp* и CTS в температурном диапазоне от -80°C до 20°C. В этом температурном диапазоне наблюдается нелинейное поведение таких параметров, как t1, t2, энергии активации Ea, а также скорости сольватационного сдвига спектров флуоресценции. Важно отметить, что в диапазоне температур -110°C - -80°C молекула Trp* сольватируется быстрее, чем CTS, тогда как при более высоких температурах (T>-80°C) скорость сольватации состояния Trp^+R^- становится больше, чем скорость сольватации Trp*. Этот факт объяснен нами тем, что в температурном диапазоне -80°C - 20°C в окружении CTS структурный (фазовый) переход захватывает большее число H-связей, чем в окружении Trp*. Именно в температурном диапазоне -80°C - 20°C происходит отступление температурной динамики переходов возбужденной молекулы триптофана от стандартного Аррениусовского поведения с постоянным значением Ea . Таким образом, динамика системы водородных связей играет определяющую роль в возникновении нелинейного характера изменения параметров, описывающих дезактивацию Trp* и CTS. Очевидно, что дальнейшее сопоставление данных результатов с аналогичными исследованиями для триптофанилов в составе белков позволит получать новую информацию о том, в какой степени различия в параметрах флуоресценции триптофана в составе функционального белка, выявляемые при размораживании охлажденных в различных условиях образцов, могут быть обусловлены непосредственными изменениями в характере его взаимодействия с белковыми молекулами и с окружающим растворителем.

The fluorescence of tryptophanils in proteins is widely used as a natural indicator of their intramolecular conformational dynamics, which is closely related to the functional activity upon temperature changes, in particular. Temperature dependences of spectrum patterns and Trp fluorescence lifetime are the reference sources for the the intramolecular dynamics behavior of the closest environment of the excited tryptophan (Trp) molecule. The Trp fluorescence decay kinetics both in solution and in polypeptides are multicomponent. Depending on the type of solvent, pH, 2–3 fluorescence components are recorded with times of hundreds of picoseconds to about 10 ns. The nature of intramolecular microconformational dynamics of the water-protein medium, which affects the functional activity, is largely determined by the state of the hydrogen bond system in the macromolecule. Certain information for understanding mechanisms of the processes occurring in this case can be obtained, among other things, by a comparative analysis of temperature dependences of the tryptophan fluorescence parameters in solution and in the protein composition.

It is on record that an ordered system of hydrogen bonds is formed in the tryptophan molecule environment in an aqueous medium. This system is shaped as a zwitterionic complex and causes a significant effect on the excitation dynamics in the Trp molecule. Here we interrogated the change in the spectral and kinetic parameters describing the decay of tryptophan fluorescence in an aqueous medium under pulsed photoexcitation as a function of temperature in the range of -170°C to +20°C. A model is proposed and a quantitative analysis of the rates of direct and reverse electronic transitions in the tryptophan molecule from the excited state to the ground state and to the charge transfer state (CTS) is carried out. Basing on the experimental and theoretical data, three regions in the Trp fluorescence spectrum were distinguished: the short-wavelength region (300 nm < l < 386 nm), the medium-wavelength region (386 nm < l <400 nm), and the long-wavelength region (400 nm < l < 470 nm), for which temperature dependences of the CTS formation rate are different. The key role of structural transformations of hydrogen bonds in the system determining the nonlinear behavior of the change in tryptophan fluorescence parameters in the selected spectral regions is shown.

The revealed nonlinear nature of the temperature dependence of the decay time of the fast (t1, a few ns) and slow (t2, about 10 ns) components of the fluorescence of an aqueous solution of tryptophan molecules is explained by appearance of an additional deactivation channel Trp* - electron transfer from the indole part of the tryptophan molecule to hydrogen bonds of the aqueous environment and then to its amide groups. As a result, a state with charge transfer Trp^+R^- is formed (where R can denote both a system of hydrogen bonds in the environment of the Trp molecule and amide groups with electron-withdrawing properties associated with Trp). Deactivation of this CTS occurs both resulting the reverse transition from this state to the excited Trp state and either due to fluorescence, or during thermal relaxation to the ground state.

The spectral-dynamic approach used in this work to study the temperature dependences of the deactivation rates of Trp excited states also allowed detection of conformational (phase) transition occurrence in the system of hydrogen bonds in the environment of Trp* and CTS within the temperature range of -80 °C to 20 °C. In this temperature range, a nonlinear behavior of such parameters as t1, t2, the activation energy Ea, and the solvation shift rate of the fluorescence spectra is observed. It is significant that in the temperature range of -110 °C - -80 °C the Trp* molecule is solvated faster than CTS, while at higher temperatures (T > -80 °C) the solvation rate of the Trp^+R^- state becomes greater than the Trp* solvation rate. We explained this fact so that in the temperature range of -80°C - 20°C in the CTS environment, the structural (phase) transition captures a greater number of H-bonds than in the Trp* environment. In such temperature range of -80°C - 20°C, temperature dynamics of the excited tryptophan molecule transitions deviate from the standard Arrhenius behavior with the constant Ea value. Thus, the hydrogen bond system dynamics are decisive for the nonlinear change in parameters describing deactivation of Trp* and CTS. It is obvious that further comparison of these results with similar studies for tryptophanils in the composition of proteins will provide new information on the extent to which differences in the fluorescence parameters of tryptophan in the composition of a functional protein detected during thawing of samples cooled under different conditions, can be due to direct changes in the nature of its interaction with protein molecules and with the surrounding solvent.