IP3-зависимый выброс депонированного Са2+ вносит ключевой вклад в агонист-индуцированную мобилизацию Са2+ в невозбудимых клетках. Эффективность фосфоинозитидного каскада, сопрягающего поверхностные рецепторы с мобилизацией внутриклеточного Са2+, модулируется рядом киназ, включая фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), которая, фосфорилируя PIP2, продуцирует фосфолипид PIP3. Ранее нами было показано, что ингибитор PI3K вортманнин не влияет на способность клеток HEK-293 генерировать Ca2+-ответы на ацетилхолин, тогда как ингибитор PI3K другой химической природы PI828 полностью подавляет эти ответы. Разная эффективность вортманнина и PI828 могла быть связана с тем, что в клетках HEK-293 функционируют изоформы PI3K, существенно более чувствительные к PI828. Для внесения ясности в этот вопрос нами была получена моноклональная линия клеток HEK-293, экспрессирующих два генетически кодируемых сенсора, а именно сенсор цитозольного Ca2+ (R-GECO1) и сенсор PIP3 PH(Akt)-Venus. Клетки этой линии позволяли одновременно регистрировать Са2+-сигналы и проводить мониторинг активности PI3K. Характерной особенностью R-GECO1 является увеличение интенсивности флуоресценции при повышении концентрации цитозольного Ca2+, в то время как PH(Akt)-Venus при PI3K-зависимой генерации PIP3 в плазмалемме перераспределяется из цитозоля в мембрану клетки. Оказалось, что ацетилхолин инициировал кратковременное повышение внутриклеточного Са2+, но не влиял на распределение PIP3-сенсора в цитоплазме клеток. Последнее указывало на отсутствие ацетилхолин-зависимой активации PI3K. В то же время инсулин, стимулирующий PI3K при участии тирозин-киназных рецепторов, вызывал перераспределение молекул PH(Akt)-Venus из цитозоля в мембрану клеток, что демонстрировало инсулин-индуцированную активность PI3K. Этот феномен не наблюдался в присутствии вортманнина или PI828, что свидетельствовало об эффективном подавлении активности PI3K этими соединениями. Таким образом, стимулируя внутриклеточную Са2+-сигнализацию в клетках HEK-293, ацетилхолин не инициировал активацию PI3K-пути, который, следовательно, не был вовлечен в холинергическую трансдукцию. Хотя полученные данные свидетельствуют об эффективном ингибировании активности PI3K вортманнином и PI828, последний подавлял ацетилхолин-индуцируемую Ca2+-сигнализацию неспецифически, т.е. воздействуя не на PI3K, а на какую-то иную клеточную мишень.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-75-10068.

In non-excitable cells, IP3-driven Са2+ release plays a pivotal role in agonist-induced Са2+ signaling. The efficiency of the phosphoinositide cascade, which couples diverse cell surface receptors to Ca2+ mobilization, is modulated by a number of kinases, including phosphoinositide 3-kinase (PI3K) that phosphorylates PIP2 to generate the phospholipid PIP3. We have previously shown that the PI3K inhibitor wortmannin does not affect acetylcholine-induced Ca2+ signaling in HEK-293 cells, while PI828, a PI3K inhibitor of distinct chemical nature, completely suppressed cellular responses to the agonist. As a possible reason for the different effectivity of wortmannin and PI828, PI3K isoforms functioning in HEK-293 could be much more sensitive to PI828. To clarify this issue, we generated a monoclonal line of HEK-293 cell, which expresses two genetically encoded sensors, namely, the cytosolic Ca2+ sensor R-GECO1 and the PIP3 sensor PH(Akt)-Venus. The cells of this line allowed for simultaneous monitoring of Ca2+ signals and PI3K activity. While R-GECO1 fluorescence is directly stimulated by Ca2+ binding, generation of PIP3 by PI3K initiates the translocation of PH(Akt)-Venus from the cytosol to the plasmalemma. It turned out that acetylcholine initiated a transient increase in the intracellular Ca2+ but did not affect the distribution of the PIP3 sensor in the cell cytosol. This indicated that acetylcholine did not stimulate PI3K activity. At the same time, insulin, which stimulates PI3K through tyrosine kinase receptors, caused the cytosol/plasmalemma translocation of PH(Akt)-Venus, thus demonstrating insulin-induced PI3K activity. This insulin-evoked translocation of PH(Akt)-Venus was canceled by wortmannin and PI828, suggesting that the inhibition of PI3K activity by these compounds was rather effective. Thus, being capable of stimulating intracellular Ca2+ signaling in HEK-293 cells, acetylcholine did not stimulate the PI3K pathway, which, therefore, was not involved in cholinergic transduction. Although the inhibition of PI3K by wortmannin and PI828 was undoubtable, the results of the present work suggest that PI828 suppressed acetylcholine-induced Ca2+ signaling nonspecifically, that is, not involving PI3K, but acting on some other cellular target.

This work was supported by the Russian Science Foundation grant № 19-75-10068.