Большинство известных зондов характеризуются невысокими значениями Стоксова сдвига, что затрудняет выделение флуоресцентного сигнала на фоне рассеянного света возбуждения, в частности излучения в УФ-области при флуоресцентной навигации. Кроме этого, большинство из них обладают достаточно высокой цитотоксичностью. Поэтому актуальной задачей остается проблема выбора и создания номенклатуры библиотек флуоресцентных молекул, обладающих меньшей энергией возбуждения и, как следствие, менее опасными для живых организмов, оптимально подходящих для идентификации бактериальных штаммов.

Отправной точкой исследования стал скрининг спектральных характеристик азолотриазиновых флуоресцентных зондов синтезированных de novo. Было использовано 4 образца зондов, которые обладали несколькими максимумами поглощения в диапазоне длин волн 361–504 нм. Первый зонд (3-метил-6-фенилимидазо[1,2-b][1,2,4]триазин-2-карбоновая кислота) – далее ФЗ-1, имел два максимума в области 361 и 523 нм, второй зонд (2-(6-оксо-2-фенилимидазо[1,2-b]пиридо[4,3-е][1,2,4]триазин-7(6Н)-ил)этансульфоновая кислота) – далее ФЗ-2, обладал двумя максимумами в области 379.5 и 504.4 нм, третий ((6-оксо-2-фенилимидазо[1,2-b]пиридо[4,3-е][1,2,4]триазин-7(6Н)-ил)уксусная кислота) – далее ФЗ-3, при 372.5 и 495 нм, а четвертый (2-(6-оксо-2-фенилимидазо[1,2-b]пиридо[4,3-е][1,2,4]триазин-7(6Н)-ил)пентандиовая кислота) – далее ФЗ-4, в области 374 и 493.5 нм. Интенсивность максимумов поглощения первых двух красителей имела схожее значение, у третьего зонда интенсивность максимума была на 27% ниже, а интенсивность максимума поглощения четвертого зонда составляла ~ 23% от интенсивности первых двух зондов. Таким образом, полученные данные предполагают различную эффективность при взаимодействии, как с отдельными молекулами белка, так и с бактериальными клетками. Поэтому, для проверки такого предположения, на следующем этапе было проведено экспериментальное тестирование изменений параметров флуоресценции на двух модельных объектах разного уровня организации. В качестве модели белка был использован коммерческий препарат белка лизоцима, а в качестве модельного микроорганизма был использован штамм Escherichia coli BL21*(DE3).

Оценка эффективности флуоресценции комплекса зонд-белок была исследована с использованием возбуждающей длинной волны, соответствующей максимумам поглощения выявленным экспериментально. Модельным белком был лизоцим –антибактериальный фермент класса гидролаз, структура и функции которого хорошо изучены. В ходе регистрации спектров флуоресценции комплекса зонд-лизоцим было выявлено смещение максимума флуоресценции для ФЗ-1 и ФЗ-3 в более коротковолновую область спектра, а для ФЗ-2 и ФЗ-4 – в длинноволновую. Помимо этого, для ФЗ-2 и ФЗ-3 в присутствии лизоцима наблюдалось падение интенсивности флуоресценции почти в 10 раз, для раствора ФЗ-1 – в 2 раза, а для раствора лизоцима и ФЗ-4 падение интенсивности составило примерно в 5 раз по сравнению с исходным значением. Спектры регистрировали непосредственно сразу после приготовления и после инкубации раствора в течение 45 минут при 37°С. Интенсивность сигнала флуоресценции свежеприготовленных образцов выходила за пределы чувствительности прибора, поэтому содержание этих красителей в пробе было снижено в 5 и в 10 раз. При снижении содержания в пробе ФЗ-1 в 10 раз интенсивность флуоресценции падала почти в два раза, а 45-ти минутная инкубация комплекса при 37°С приводила к еще двукратному понижению интенсивности. Однако, уменьшение содержания этого зонда в 5 раз, наоборот, вызывало почти двукратное увеличение флуоресценции, которая снижалась в течение 45 минут при 37°С, но не достигала исходного значения. Снижение содержание в пробе ФЗ-2 и ФЗ-3 носило сходный характер. Их разбавление в 10 и в 5 раз приводило почти к 10-ти и 5-ти кратному снижению сигнала флуоресценции, а после инкубации при 37°С в течение 45 минут сигнал снижался еще почти в два раза. Использование ФЗ-4 приводило к изменению сигнала, аналогичным, как и в экспериментах с ФЗ-1. Тем не менее стоит отметить, что исходная интенсивность флуоресценции ФЗ-4 была на 27% ниже, чем первого.

Цитохимическое окрашивание клеток E.coli проводили по модифицированному и оптимизированному протоколу. Для получения изображений был использован флуоресцентный микроскоп Nikon Eclipse Ni-E с возбуждающей длиной волны 260-380 нм. В качестве контроля были использованы клетки, не обработанные красителем. Полученные данные свидетельствуют о том, что в контрольной группе сигналы флуоресценции от объектов, размеры которых сопоставимы с клетками E.coli, не обнаружены. Результаты окрашивания клеток с использованием ФЗ-2 и ФЗ-3 не дали значимых результатов, что согласуется с данными спектральных исследований. Цитохимическое окрашивание клеток с использованием ФЗ-4 давало сигнал, но интенсивность его была значительно ниже, а число объектов было меньше, по сравнению со случаем использования ФЗ-1.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что химическая структура и свойства флуоресцентных зондов в значительной степени отличаются. Оптимальным, для решения поставленной задачи, является зонд ФЗ-1. Учитывая тот факт, что значительного снижения роста бактериальных клеток не происходило при добавлении зонда ФЗ-1, то его можно рассматривать в качестве потенциального низкотоксичного красителя для изучения цитоархитектоники биосистем методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Для улучшения показателей ФЗ-2 и ФЗ-3 и, отчасти, ФЗ-4 требуются внедрение дополнительных химических якорных групп (введение иных групп, заместителей и т.д.) для лучшей связки с матриксом бактериальных клеток, что может быть связано с более тщательной синтетической переработкой для увеличения сдвига Стокса в более длинноволновую область спектра.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук (проект МК-4978.2022.1.3).

Most of the known probes are characterised by low values of Stokes shift, which makes it difficult to distinguish the fluorescent signal against the scattered excitation light, in particular, radiation in the UV-region during fluorescence navigation. In addition, most of them have a rather high cytotoxicity. Therefore, the problem of selecting and creating a nomenclature of fluorescent molecule libraries with lower excitation energy and, consequently, less harmful for living organisms, optimally suited for the identification of bacterial strains, remains a topical issue.

The starting point of the study was the screening of the spectral characteristics of azolotriazine fluorescent probes synthesised de novo. Four sample probes were used, which had multiple absorption maxima in the wavelength range 361-504 nm. The first probe (3-methyl-6-phenylimidazo[1,2-b][1,2,4]triazine-2-carboxylic acid) - hereafter FZ-1, had two maxima in the 361 and 523 nm region, The second probe (2-(6-oxo-2-phenylimidazo[1,2-b]pyrido[4,3-e][1,2,4]triazine-7(6H)-yl)ethanesulfonic acid) - hereafter FZ-2, had two maxima in the region of 379. 5 and 504.4 nm, the third ((6-oxo-2-phenylimidazo[1,2-b]pyrido[4,3-e][1,2,4]triazine-7(6H)-yl)acetic acid) - hereafter FZ-3, at 372. 5 and 495 nm, and the fourth (2-(2-(6-oxo-2-phenylimidazo[1,2-b]pyrido[4,3-e][1,2,4]triazine-7(6H)-yl)pentandioic acid) is further FZ-4, in the region of 374 and 493.5 nm. The intensity of the absorption maxima of the first two dyes was similar, the third probe had a 27% lower intensity maximum, and the intensity of the absorption maximum of the fourth probe was ~ 23% of the intensity of the first two probes. Thus, the data obtained suggest different efficiencies in the interaction with both individual protein molecules and bacterial cells. Therefore, to test this assumption, the next step was to experimentally test changes in fluorescence parameters on two model objects of different levels of organisation. A commercial preparation of lysozyme protein was used as a protein model and Escherichia coli strain BL21*(DE3) was used as a model microorganism.

Evaluation of the fluorescence efficiency of the zone-protein complex was investigated using an excitation wavelength corresponding to the absorption maxima identified experimentally. The model protein was lysozyme, an antibacterial enzyme of the class of hydrolases, whose structure and functions are well studied. Registration of fluorescence spectra of the probe-lysocim complex revealed shift of fluorescence maximum of FZ-1 and FZ-3 into shorter wavelength region of spectrum, and of FZ-2 and FZ-4 into longer wavelength region. In addition, a nearly 10-fold decrease in fluorescence intensity was observed for FZ-2 and FZ-3 in the presence of lysozyme, a 2-fold decrease for FZ-1 solution, and about 5-fold decrease for lysozyme solution and FZ-4 as compared with the initial value. Spectra were recorded immediately after preparation and after incubation of the solution for 45 min at 37°C. The fluorescence signal intensity of the freshly prepared samples was outside the sensitivity limits of the instrument, so the content of these dyes in the sample was reduced by a factor of 5 and a factor of 10. A 10-fold decrease in FZ-1 in the sample resulted in an almost two-fold decrease in fluorescence intensity, and a 45-minute incubation of the complex at 37°C resulted in a further two-fold decrease in intensity. However, a 5-fold decrease in the content of this probe, by contrast, caused an almost two-fold increase in fluorescence, which decreased within 45 minutes at 37 °C, but did not reach the initial value. The decrease of FZ-2 and FZ-3 in the sample had a similar pattern. Their dilution by a factor of 10 and 5 led to a decrease of fluorescence signal by a factor of 10 and 5, and after incubation at 37 °C for 45 min the signal was reduced by almost two times more. The use of FZ-4 resulted in signal changes similar to those in experiments with FZ-1. However, it is worth noting that the initial fluorescence intensity of FZ-4 was 27% lower than that of FZ-1.

Cytochemical staining of E.coli cells was performed using a modified and optimised protocol. A Nikon Eclipse Ni-E fluorescence microscope with an excitation wavelength of 260-380 nm was used for imaging. Cells not treated with the dye were used as a control. The data obtained indicated that no fluorescence signals were detected in the control group from objects of comparable size to E.coli cells. The results of cell staining using FZ-2 and FZ-3 gave no significant results, which is in agreement with the spectral findings. Cytochemical staining of cells using FZ-4 gave a signal, but its intensity was significantly lower and the number of objects was lower compared to the case of using FZ-1.

Thus, it can be concluded that the chemical structure and properties of the fluorescent probes differ significantly. The FZ-1 probe is optimal for the task at hand. Taking into consideration the fact, that a significant decrease of bacterial cell growth did not occur when FZ-1 probe was added, it could be considered as a potential low-toxic dye for the study of cytoarchitectonics of biosystems by fluorescence correlation spectroscopy. To improve FZ-2 and FZ-3, and partially FZ-4, the introduction of additional chemical anchoring groups (introduction of other groups, substituents, etc.) for better binding to the bacterial cell matrix, which can be associated with a more thorough synthetic processing to increase the Stokes shift into the longer wavelength region of the spectrum, is required.

This work was supported by a grant from the President of the Russian Federation for state support of young Russian PhD scientists (project MK-4978.2022.1.3).