Понимание основ восприятия организмами световых и цветовых сигналов из окружающей среды – это важная задача биофизики. Большинство видов позвоночных имеют зрительную систему, основанную на опсинах чувствительных к красному, зелёному, синему и УФ свету [Bowmaker, 2008]. Danio rerio является удобной моделью в эмбриологии, её геном секвенирован [Howe et al., 2013], многие опсины клонированы и определены их спектральные характеристики [Robinson et al., 1993; Vihtelic et al., 1999]. Тем не менее, причины цветовых предпочтений D. rerio и их смена во время индивидуального развития остаются недостаточно изучены [Peeters et al., 2016]. Интересно связать количество цветных опсинов, обнаруженных у D. rerio, и их структурные особенности с паттернами поведения рыб под разными источниками света.

D. rerio содержали в аквариуме 41х25х35 см при 25°C и суточном освещении. Эксперименты проводили в аквариуме, либо в каналах. Применяли полупроводниковые лазеры мощностью ~1 Вт: красный (650 нм), зелёный (532 нм) и синий (405 нм), а также миниатюрный УФ (395 нм) источник света и цветные светодиоды (LEDs): красный (620 нм), зелёный (529 нм) и синий (470 нм), а также белый. Светодиоды подключали к плате Arduino для импульсного освещения со случайными вспышками света и паузами между ними длительностью до 1 с. Лазерный луч направляли на рыб, плавающих в аквариуме при дневном свете либо в темноте. Оценивали поведенческие реакции при остром световом воздействии. В другом варианте опытов, D. rerio помещали в каналы белого цвета (200х6х3 см) или каналы, раскрашенные в разные цвета (100х6х3 см). Иногда часть канала закрывали крышкой от дневного света, имитируя грот с одним или тоннель с двумя входами-выходами. Светодиоды размещали с краю или в центре канала над поверхностью воды так, чтобы они светили вниз в полной темноте. После 3 мин экспозиции, в воду опускали перегородки и подсчитывали долю рыб в отсеках. Каждый опыт повторяли 3 раза. Исследование длилось 2 месяца и состояло из нескольких серий, в которых участвовало 20 особей в возрасте от 1 месяца.

Аминокислотные последовательности опсинов D. rerio искали в базе данных NCBI. Множественное выравнивание полипептидных последовательностей выполняли на сервере Clustal Omega. Пространственные модели опсинов строили на сервере Phyre2. Докинг ретиналя осуществляли на сервере SwissDock.

Обнаружено, что на свету D. rerio проявляют выраженную реакцию на зелёный и синий лазеры, а в темноте бурно реагируют на зелёный лазер и заметно на лучи остальных цветов (белый, красный, синий, УФ), что коррелирует с содержанием чувствительных к зелёному свету опсинов (4 гомолога).

При рассеянном дневном свете D. rerio равномерно распределяются по каналу, 2/3 рыб прячутся в гроте и практически все собираются в тоннеле. Этот факт предполагает участие 4 типов опсинов (красный, зелёный, синий, УФ) в обработке белого света.

В двухцветных каналах рыбы сосредотачивались в красной половине и не задерживались в белой части; в зелёной части собиралось в ~2 раза меньше рыб, чем в голубой; при сравнении красного цвета с зелёным, D. rerio выбирали красный. Наблюдения свидетельствуют, что D. rerio предпочитает основные цвета в следующем порядке: красный ≈ голубой > зелёный > белый, причём белый цвет и освещённые участки являются наименее предпочтительными. В таких местах рыбки задерживаются лишь на короткое время, что согласуется с [Avdesh et al., 2012].

При постоянном освещении LEDs, рыбы были индифферентны к белому и красному свету. Напротив, D. rerio уходили от постоянного зелёного или синего света. Случайные вспышки белого света пугали рыб и они хаотично распределялись по каналу. Цветные случайные вспышки оказывали менее выраженный эффект, что снова указывает на комплексную обработку входных световых сигналов нервной системой [Connaughton et al., 2021].

Корреляция между опытами с расположением источников света (W, R, G, B) с краю или в центре канала для постоянного освещения составляет r=0,62, а для случайных вспышек света r=-0,04. Этот результат говорит о закономерной реакции рыб на постоянное освещение разного цвета и о непредсказуемой реакции на случайные вспышки, что напоминает испуг [Koyama et al., 2021].

Обнаружено 145 опсино-подобных белков D. rerio, из них проанализирован 121 опсин. Выявлено 9 кластеров: чувствительные к красному, зелёному, синему и УФ свету опсины, родопсины, меланопсины, опсины костных рыб, древние опсины позвоночных и неохарактеризованные протеины. Наибольший интерес представляют 4 группы опсинов чувствительных к красному, зелёному, синему и УФ свету. Число опсинов было редуцировано до 11 уникальных полипептидов.

Охарактеризованы следующие опсины: NP_001300644.1 (R-опсин 1, 357 аа, 39,89 кДа) и NP_001002443.1 (R-опсин 2, 356 аа, 39,51 кДа), NP_571328.2 (G-опсин 1, 349 аа, 38,85 кДа), NP_878311.1 (G-опсин 2, 349 аа, 38,71 кДа), NP_878312.1 (G-опсин 3, 349 аа, 38,89 кДа) и NP_571329.1 (G-опсин 4, 349 аа, 38,72 кДа), чувствительный к синему цвету опсин колбочек BAC24133.1 (354 аа, 39,49 кДа), 2 коротковолновых опсина колбочек AAH60894.1 (336 аа, 37,26 кДа) и AAH67683.1 (336 аа, 37,28 кДа), а также 2 чувствительных к УФ опсина колбочек AAD24756.1 (336 аа, 37,15 кДа) и BAC24134.1 (336 аа, 37,27 кДа).

Отмечены уникальные N-терминальные пептиды, а также делеция в C-терминальной области у красных опсинов, кроме того, ниже по последовательности обнаружена делеция у УФ опсинов, при этом у зелёных опсинов делеция находится на N-конце. Выявлена дивергентная эволюция УФ опсинов AAD24756.1 и BAC24134.1. Ретиналь встраивается в 3D-модели УФ опсинов со значениями -ΔG: 8,68 для AAH60894.1, 8,62 для AAH67683.1, 8,58 для BAC24134.1 и 8,45 ккал/моль для протеина AAD24756.1.

Из экспериментов и расчётов следует, что D. rerio способна различать как минимум 2 оттенка красного, 4 оттенка зелёного, синий и, возможно, не менее 2 оттенков УФ цвета на определённых этапах эмбриогенеза, процессировать полученную информацию в нейронной сети и принимать решения, выражающиеся в двигательной активности.

Understanding the basis of light and colour signal perception by organisms in the environment is an important task of biophysics. Most vertebrate species have a visual system based on opsins sensitive to red, green, blue and UV light [Bowmaker, 2008]. Danio rerio is a convenient model in embryology. Its genome has been sequenced [Howe et al., 2013], many opsins have been cloned and their spectral characteristics have been determined [Robinson et al., 1993; Vihtelic et al., 1999]. However, the reasons for the colour preferences of D. rerio and their change during individual development remain poorly understood [Peeters et al., 2016]. It is interesting to relate the number of coloured opsins found in D. rerio and their structural features to fish behaviour patterns under different light sources.

D. rerio was kept in a 41x25x35 cm aquarium at 25°C with daily light. Experiments were carried out in the aquarium or in channels. We used ~1 W semiconductor lasers: red (650 nm), green (532 nm) and blue (405 nm), and a miniature UV (395 nm) light source and coloured LEDs: red (620 nm), green (529 nm) and blue (470 nm), and white. The LEDs were connected to an Arduino board for pulsed illumination with random flashes of light and pauses of up to 1 s in between. The laser beam was directed at fish swimming in the aquarium in daylight or in the dark. Behavioural reactions during acute light exposure were investigated. In another variant of the experiments, D. rerio was placed in white channels (200x6x3 cm) or channels painted in different colours (100x6x3 cm). Sometimes a part of the channel was covered with daylight cover, simulating a grotto with one or a tunnel with two entrances-exits. LEDs were placed at the edge or in the centre of the channel above the water surface so that they shone downwards in total darkness. The baffles were lowered into the water after 3 minutes of exposure and the proportion of fish in the compartments was counted. Each experiment was repeated 3 times. The study lasted for 2 months and consisted of several series with 20 fishes from 1 month of age.

The amino acid sequences of D. rerio opsins were searched in the NCBI database. Multiple polypeptide sequence alignment was performed on the Clustal Omega server. Spatial models of opsins were constructed on the Phyre2 server. Retinal docking was performed on a SwissDock server.

D. rerio was found to exhibit a pronounced response to green and blue lasers in light, while in darkness it reacts vigorously to green lasers and markedly to other colours (white, red, blue, UV), which correlates with the content of green light sensitive opsins (4 homologues).

D. rerio are evenly distributed in the channel in diffused daylight, 2/3 of the fishes hide in the grotto and almost all are collected in the tunnel. This fact suggests that 4 types of opsins (red, green, blue, UV) are involved in white light processing.

Fishes concentrated in the red half and did not stay in the white part in the two-coloured channels; ~2 times fewer fishes were collected in the green part than in the blue part; D. rerio chose red when comparing red with green. Observations indicate that D. rerio prefers the main colours in the following order: red ≈ blue > green > white, with white and bright areas being the least preferred. Fish stays in these areas only for a short time, which is consistent with [Avdesh et al., 2012].

The fishes were indifferent to white and red light under constant LED illumination. In contrast, D. rerio moved away from constant green or blue light. Random flashes of white light frightened the fishes and they were distributed chaotically in the channel. Coloured random flashes had a less pronounced effect, again indicating complex processing of light inputs by the nervous system [Connaughton et al., 2021].

The correlation between experiments with location of light sources (W, R, G, B) at the edge or in the centre of the channel for constant light is r=0.62 and for random light flashes r=-0.04. This result suggests a patterned response of fishes to constant lighting of different colours and an unpredictable response to random flashes, resembling startle [Koyama et al., 2021].

A total of 145 opsin-like proteins of D. rerio were detected, of which 121 opsins were analysed. Nine clusters were identified: red, green, blue and UV-sensitive opsins, rhodopsins, melanopsins, teleost multiple tissue opsins, ancient vertebrate opsins and uncharacterised proteins. Of most interest are 4 groups of opsins sensitive to red, green, blue and UV light. The number of opsins has been reduced to 11 unique polypeptides.

The following opsins were characterized: NP_001300644.1 (R-opsin 1, 357 aa, 39.89 kDa) and NP_001002443.1 (R-opsin 2, 356 aa, 39.51 kDa), NP_571328.2 (G-opsin 1, 349 aa, 38.85 kDa), NP_878311.1 (G-opsin 2, 349 aa, 38.71 kDa), NP_878312.1 (G-opsin 3, 349 aa, 38.89 kDa) and NP_571329.1 (G-opsin 4, 349 aa, 38.72 kDa), the blue-sensitive cone opsin BAC24133.1 (354 aa, 39.49 kDa), 2 short-wave cone opsins AAH60894.1 (336 aa, 37.26 kDa) and AAH67683.1 (336 aa, 37.28 kDa), and 2 UV-sensitive opsins of cones AAD24756.1 (336 aa, 37.15 kDa) and BAC24134.1 (336 aa, 37.27 kDa).

Unique N-terminal peptides were observed, as well as a deletion in the C-terminal region in red opsins; in addition, a deletion was found downstream in UV opsins, with the deletion at the N-terminus in green opsins. A divergent evolution of the UV opsins AAD24756.1 and BAC24134.1 was detected. Retinal is incorporated into the 3D models of UV opsins with -ΔG values: 8.68 for AAH60894.1, 8.62 for AAH67683.1, 8.58 for BAC24134.1 and 8.45 kcal/mol for AAD24756.1.

It follows from experiments and calculations that D. rerio is able to distinguish at least 2 shades of red, 4 shades of green, blue and possibly no less than 2 shades of UV light during certain stages of embryogenesis, to process the received information in a neural network and to make decisions expressed in motor activity.