Рецепторы P2Y (P2YRs), семейство пуринергических рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), активируются внеклеточными нуклеотидами. Существует в общей сложности восемь различных функциональных P2YRs, экспрессируемых у человека, которые подразделяются на P2Y1-подобные рецепторы и P2Y12-подобные рецепторы. Их лиганды, как правило, представляют собой заряженные молекулы с относительно низкой биодоступностью и стабильностью in vivo, что ограничивает понимание этого семейства рецепторов. P2Y12R регулирует активацию тромбоцитов и образование тромба. Тромб, вызванный аномальной активацией тромбоцитов, является патологической основой для формирования многих заболеваний. При различных физиологических и патологических состояниях тромбоциты могут активироваться и подвергаться таким процессам, как адгезия, деформация, агрегация, высвобождение частиц и синтез тромбоксана А2, что в конечном итоге приводит к физиологическому гемостазу или патологическому тромбозу.

В области сердечно-сосудистых заболеваний предпринимаются активные попытки использовать метод комбинационного рассеяния света (КРС) в биомедицинских исследованиях тромбоцитов. КРС - неинвазивный и высокочувствительный аналитический метод, который позволяет получить «отпечатки пальцев» молекул. Его можно использовать в качестве инструмента для анализа неизвестных образцов или молекул-мишеней в смеси компонентов. С целью увеличить сигналы исследуемых образцов используется метод гигантского комбинационного рассеяния света (ГКРС). Благодаря усилению электромагнитных полей вокруг металлических наночастиц возможно исследование молекулярной структуры, проведение детекции малоконцентрированных веществ. Наночастицы золота различной структуры могут быть использованы для получения спектров ГКРС плазмы, крови и тромбоцитов, в частности, от здоровых пациентов и тех, кто принимает лекарства от тромбоза. Однако неизвестно как влияют наночастицы на тромбоциты и его рецепторы, а также какое взаимодействие между ними происходит.Здесь мы впервые выполнили молекулярное моделирование белка P2Y12 с золотой поверхностью. Результаты данного исследования могут дать понимание в механизмах взаимодействия наночастиц с биологическими объектами, а также стать началом для дальнейшего исследования и моделирования взаимодействия тромбоцитов с наночастицами.

Поскольку известная структура, полученная с помощью дифракции рентгеновского излучения, имеет артефакты и пустые места кристаллической решетки, мы выполнили достраивание белка с помощью гомологичного моделирования. Аминокислотную последовательность P2Y12 человека (PDB: 4NTJ) использовали в качестве последовательности запроса для поиска моделей гомологов с известными структурами из банка данных белков (PDB) с использованием NCBI-BLAST. Для гомологичного моделирования был выбран аналогичный белок P2Y12 человека (PDB: 4PZX). Трехмерная модель P2Y12 человека была создана с помощью программы MODELLER (версия 10.2).

Структуры белка и золота использовались как начальные координаты для моделирования. Был построен кубический ящик размером 160х160х200A3 включающий молекулы воды TIP3P с добавлением ионов хлора для уравновешивания заряда, белок и поверхность золота Au(111). Белок располагали на расстоянии примерно 60 A от поверхности.

Все симуляции были выполнены с помощью пакета GROMACS 2021.5. Во всех симуляциях для моделирования пептида был выбран CHARMM27, а для представления воды был использован модифицированный потенциал TIP3P. Взаимодействия пептид–золото на каждой из различных водных границ раздела золота были описаны GolP-CHARMM. Длины связей были ограничены h-bonds. Поверхностные атомы золота и объемные атомы золота были заморожены во время всех симуляций, но дипольные заряды золота оставались свободными. Классическое МД-моделирование проводилось при постоянном объеме и температуре (T = 300 K). Использовались периодические граничные условия, алгоритм PME и временной шаг интегрирования 2 фс.

Полные электростатические энергии систем (1-4 энергия ван-дер-Ваальса, 1-4 электростатическая энергия) были рассчитаны по параметрам элементарной ячейки, чтобы понять структурные перестройки белка.

Для оценки поведения белка в присутствии золотой наночастицы проводилось моделирование в течении 5000 пкc. В начале моделирования белок отдаляется от наночастицы на расстоянии около 4 нм, после 1500 пк происходит сближение до примерно 3,5 нм, а после 3500 пкc снова происходит отдаление до 4,5 нм.

Оценка эволюции радиуса вращения во времени в течение всего времени моделирования, показала уменьшение значения на десятые единицы с 3,4 до 3,15 нм, что свидетельствует о плотной упаковке белка. В основном, развертывание и изменение конформации связано с гибким внутриклеточным участком белка.

Далее были рассчитаны как потенциал Леннарда-Джонса, так и кулоновский электростатический потенциал. Потенциал Леннарда-Джонса описывает потенциальную энергию взаимодействия между двумя не связывающимися атомами или молекулами в зависимости от расстояния их разделения. Это полезно для учета отталкивания Паули и гидрофобных/Ван-дер-Ваальсовых притяжений. С другой стороны, кулоновский потенциал может описывать электростатические взаимодействия между атомными (частичными) зарядами. Полная энергия системы немного снижалась в ходе моделирования с -5278469 до -5280000 кдж\моль. Потенциал Леннарда-Джонса повышался в течении всего моделирования от 880250 до 883488 кдж\моль. Значение электростатического потенциала повышалось к 2200 пкc моделирования до уровня в 65000 кдж\моль, далее снизилось до 64500 кдж\моль в течение 1500 пкc, а после к 5000 кпc возвращалось к максимальному уровню около 64875 кдж\моль.

Результаты нашего моделирования свидетельствуют о том, что агрегации белка P2Y12 на поверхности наночастицы не происходит, а конформации белка не изменяется. Эти данные могут создать базу для дальнейшего моделирования P2Y12 с наночастицами других форм, а также для моделирования влияния наночастиц на участок тромбоцитарной мембраны с данным рецептором.

P2Y receptors (P2YRs), a family of G protein-coupled purinergic receptors (GPCRs), are activated by extracellular nucleotides. There is a total of eight different functional P2YRs expressed in humans, which are classified into P2Y1-like receptors and P2Y12-like receptors. Their ligands are typically charged molecules with relatively low in vivo bioavailability and stability, limiting understanding of this receptor family. P2Y12R regulates platelet activation and thrombus formation. Thrombus caused by abnormal activation of platelets is the pathological basis for the formation of many diseases. Under various physiological and pathological conditions, platelets can be activated and undergo processes such as adhesion, deformation, aggregation, release of particles and synthesis of thromboxane A2, which ultimately leads to physiological hemostasis or pathological thrombosis.

In the field of cardiovascular diseases, active attempts are being made to use the method of Raman Spectroscopy in biomedical studies of platelets. Raman Spectroscopy is a non-invasive and highly sensitive analytical method that allows you to get "fingerprints" of molecules. It can be used as a tool to analyze unknown samples or target molecules in a mixture of components. Surface enhanced Raman Spectroscopy (SERS) is based on the amplification of electromagnetic fields around metal nanoparticles, which greatly increases the Raman scattering signals of a sample surrounded by nanoparticles. There are reports on the use of gold nanoparticles of different structures to obtain SERS spectra of plasma, blood and platelets, in particular, from healthy patients and those taking anti-thrombotic drugs. However, it is not known how nanoparticles affect platelets and its receptors, as well as what kind of interaction between them occurs.

Here, for the first time, we performed molecular modeling of the P2Y12 protein with a golden surface. The results of this study can provide insight into the mechanisms of interaction of nanoparticles with biological objects, as well as become the basis for further research and modeling of the interaction of platelets with nanoparticles.

Since the known structure obtained by X-ray diffraction has artifacts and empty spaces in the crystal lattice, we completed the completion of the protein using homologous modeling. The human P2Y12 amino acid sequence (PDB: 4NTJ) was used as a query sequence to search for homologue models with known structures from the Protein Data Bank (PDB) using NCBI-BLAST. A similar human P2Y12 protein (PDB: 4PZX) was chosen for homologous modeling. The 3D human model P2Y12 was created using the MODELER program (version 10.2).

The protein and gold structures were used as initial coordinates for the simulation. A cubic box with a size of 160x160x200A3 was built, including TIP3P water molecules with the addition of chlorine ions to balance the charge, protein and the gold surface Au(111). The protein was placed at a distance of about 60 Å from the surface. All simulations were performed using the GROMACS 2021.5 package. In all simulations, CHARMM27 was chosen to model the peptide, and a modified TIP3P potential was used to represent water. Peptide–gold interactions at each of the various gold water interfaces have been described by GolP-CHARMM. Bond lengths were limited by h-bonds. Surface gold atoms and bulk gold atoms were frozen during all simulations, but gold dipole charges remained free. Classical MD simulation was carried out at a constant volume and temperature (T = 300 K). Periodic boundary conditions, the PME algorithm, and an integration time step of 2 fs were used.

The total electrostatic energies of the systems (1-4 van der Waals energy, 1-4 electrostatic energy) were calculated from unit cell parameters to understand protein structural rearrangements.

To evaluate the behavior of the protein in the presence of a gold nanoparticle, simulations were performed for 5000 ps. At the beginning of the simulation, the protein moves away from the nanoparticle at a distance of about 4 nm, after 1500 ps it approaches to about 3.5 nm, and after 3500 ps it again moves away to 4.5 nm.

Evaluation of the evolution of the radius of rotation in time during the entire simulation time showed a decrease in the value by tenths of units from 3.4 to 3.15 nm, which indicates a dense packing of the protein. Basically, the unfolding and conformational change is associated with a flexible intracellular region of the protein.

Next, both the Lennard-Jones potential and the Coulomb electrostatic potential were calculated. The Lennard-Jones potential describes the potential energy of interaction between two non-bonding atoms or molecules depending on the distance of their separation. This is useful for accounting for Pauli repulsion and hydrophobic/van der Waals attractions. On the other hand, the Coulomb potential can describe electrostatic interactions between atomic (partial) charges. The total energy of the system slightly decreased during the simulation from -5278469 to -5280000 kJ/mol. The Lennard-Jones potential increased throughout the simulation from 880250 to 883488 kJ/mol. The value of the electrostatic potential increased by 2200 ps of simulation to a level of 65000 kJ/mol, then decreased to 64500 kJ/mol for 1500 ps, and after 5000 ps it returned to the maximum level of about 64875 kJ/mol.

The results of our modeling indicate that there is no aggregation of the P2Y12 protein on the surface of the nanoparticle, and the protein conformation does not change. These data can form the basis for further modeling of P2Y12 with nanoparticles of other shapes, as well as for modeling the effect of nanoparticles on the area of the platelet membrane with this receptor.