Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) — мощный аналитический метод, используемый в биофизике для изучения стабильности и денатурации белков. Он основан на измерении количества теплоты, выделяемого или поглощаемого при физическом или химическом процессе в образце в ходе изменения его температуры. ДСК обычно используется для характеристики термических свойств индивидуальных белков в различных условиях, оптимизации термостабильности белка или характеристики моноклональных антител и вакцинных антигенов.

ДСК также может применяться для изучения связывания между белками и лигандами, что используется гораздо реже и обычно на качественном уровне. Связывание лиганда с нативным белком приводит к повышению температуры его денатурации, однако нет простой зависимости между сдвигом температуры плавления и термодинамической константой связывания. Нами разработана программа для численного моделирования кривой ДСК в системах белок-лиганд с различной стехиометрией связывания. Расчеты выполняются для обратимой денатурации в предположении, что при любой температуре в процессе сканирования быстро устанавливаются равновесия фолдинга-анфолдинга и связывания. Это верно для низких скоростей сканирования.

Используя известные термодинамические параметры денатурации и связывания нескольких лекарственных веществ для бычьего сывороточного альбумина, были рассчитаны калориметрические кривые для различных соотношений лиганд:белок. Затем были записаны экспериментальные термограммы для тех же систем с помощью капиллярного ДСК-калориметра. Наблюдалась хорошая воспроизводимость максимальных температур пиков денатурации и площадей пиков при избытках лиганда ниже 5:1. Более высокие концентрации лиганда приводят к более сильным, чем предсказывает модель, температурным сдвигам, что можно объяснить наличием дополнительных сайтов связывания со слабым сродством.

Затем была решена обратная задача определения констант связывания по данным ДСК для ряда лекарственных лигандов. Нами была экспериментально измерена температура максимума пика и площадь пика при различных концентрациях лиганда и определены первая и вторая последовательные константы связывания белок-лиганд, при которых модель дает наилучшее согласие с экспериментом. Затем эти значения были независимо подтверждены измерениями методом изотермической титрационной калориметрии.

Результаты показывают, что метод ДСК может использоваться для количественной характеристики взаимодействий между белками и другими молекулами, чтобы лучше понять их механизм и выявить связь между структурой и аффинностью. Анализ различий в аффинности связывания между различными лигандами может быть использован для дизайна и скрининга потенциальных кандидатов при разработке новых лекарств. Существенным преимуществом метода ДСК является его высокая воспроизводимость.

Работа выполнена за счет средств Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета.

Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a powerful analytical technique used in biophysics to study the stability and denaturation of proteins. DSC relies on measuring the amount of heat evolved or absorbed upon a physical or chemical transition in a sample as its temperature is raised or lowered. It is commonly used for characterization of the thermal properties of individual proteins at different conditions, design of thermostable proteins, or characterization of monoclonal antibodies and vaccine antigens.

DSC can also able to study the binding interactions between proteins and ligands, which has been done much less commonly and usually in a qualitative manner. Ligand binding to the native protein results in an increase of its denaturation temperature, however, there is no simple relationship between the melting point shift and the thermodynamic binding constant. We developed a program for the numerical simulation of the DSC curve in protein-ligand systems with different binding stoichiometry. The calculations are made for a reversible denaturation model in an assumption that at any temperature during the scan, the folding-unfolding and binding-unbinding equilibria are established. This is true for the slow scanning rates.

Using known thermodynamic parameters of denaturation and binding of several drug substances for bovine serum albumin, we predicted the calorimetric curves for various ligand:protein ratios. Then the experimental thermograms for the same systems were recorded using a capillary DSC instrument. A good reproducibility of the denaturation peak maximum temperatures and the peak areas was observed for the ligand excess below 5:1. Higher ligand concentrations lead to the stronger than predicted temperature shifts which can be explained by the binding to the additional binding sites with weaker affinity.

The inverse problem of determining the binding constants from the DSC data was then solved for a number of drug ligands. We fitted the experimental temperature of the peak maximum and the peak area at different ligand concentrations and determined the first and second sequential protein-ligand binding constants for which the model gives the best agreement. These values were then independently confirmed by the isothermal titration calorimetry measurements.

The results indicate that DSC may help researchers to quantify the interaction strength between proteins and small molecules in order to better understand the mechanism of interaction and reveal the structure-affinity relationships. The insight into the differences in binding affinity among different ligands can be used to design and screen prospective drug candidates in de novo drug design. A significant advantage of the DSC method is its high reproducibility.

This work has been supported by the Kazan Federal University Strategic Academic Leadership Program.