Суперсемейство АРС (amino acid-polyamine-orhanocation)-транспортеров у человека состоит из многочисленных семейств растворимых носителей (SLC – solute carrier). Транспорт аминокислот через мембрану клеток осуществляется при помощи вторичного активного транспорта и глутатионовой транспортной системы. Вторичный активный транспорт – это перенос веществ с использованием градиента концентрации натрия или протонов между внутренней и наружной сторонами клеточной мембраны. Канонические АРС-транспортеры включают SLC7 глутамат/цистеин натрий-независимый антипортер, обменивающий внеклеточный цистеин на внутриклеточный глутамат [1, 2]. Катионные аминокислотные транспортеры (CATs – cationic amino acid transporter) также являются членами SLC7-семейства. Они поставляют аргинин для синтеза оксида азота, вносящего основной вклад в патогенез астмы [3]. В опухолях APC L-тип аминокислотный транспортер I обеспечивает клетки аминокислотами, необходимыми для роста опухолевых клеток, нарушает регуляцию опухолевых клеток [4] и опосредует включение мелфалина, препарата, используемого в хемотерапии [5]. В центральной нервной системе транспортеры семейство SLC12 играют существенную роль в установлении концентрации хлорида и γ-аминомасляной кислоты (GABA) и глицин-опосредованной нейротрансмиссии [6]. Другие АРС транспортеры участвуют в многообразных биохимических процессах в нервной системе, включая упаковку ингибиторов нейротрансмиттеров в синаптических везикулах [7] и натрий- или протон-зависимом симпорте глутамина, критическом этапе в рециклизации глутамата и GABA [8]. Для более глубокого понимания АРС-транпортеров в целом и для понимания общих черт и различий между протон- и натрий-сцепленными транспортерами мы изучали атомную структуру и механизм протон-зависимого эукариотического дрожжевого АРС-транспортера.

Включение аминокислот в клетки дрожжей опосредуются ~16 плазмо-мембранными пермиазами, большинство из которых принадлежат к АРС–суперсемейству транспортеров, найденных во всех живых организмах. У дрожжей включение аргинина осуществляется в основном тремя пермиазами Gap1, Can1, Alp1, работающими и как транспортер, и как рецептор. Основная аминокислотная пермиаза Gap1 транспортирует все аминокислоты, Alp1 – только аргинин, Can1 – аргинин и менее эффективно лизин. Can1 катализирует Н+/аргинин симпорт и для переноса нужна протон-движущая сила [9].

Дрожжевая аргининовая пермиаза Can1 – гомодимер и состоит из 590 а.о. Кристаллическая структура эукариотических дрожжевых пермиаз в настоящее время в базе данных PDB отсутствует, однако имеются атомные структуры трех бактериальных белков семейства АРС: антипортеры аргинин/агматин (AdiC) и глютамат/γ-аминомаслянная кислота (GadC) и протон/аминокислотный симпортер широкой специфичности (ApcT). По структуре белки аналогичны и состоят из 12 альфа-спиральных трансмембранных сегментов (ТМ), фланкирующих гидрофильный хвост, направленный в цитоплазму. ТМ образуют два кольца «5+5», которые охватывают сайт связывания субстрата. ТМ11 и ТМ12 осуществляют связывание мономеров. Такая укладка типична для нескольких семейств транспортеров.

Ранее [10, 11] для моделирования мы использовали кристаллическую структуру мономера AdiC (PDB: 3L1L и 3OB6) [12, 13] в открытой конформации в водном окружении с аргинином в качестве субстрата. В данной работе в качестве базы для моделирования Can1 мы использовали кристаллическую структуру гомодимера AdiC высокого разрешения 1.7 Å (PDB: 7O82), встроенного в мембрану, гидратированную слоем воды толщиной 17 Å [14]. Эта система была собрана с помощью пакета CHARMM-GUI [15]. Далее система уравновешивалась и моделировалась при температуре 310 K с помощью пакета Gromacs версии 2022.4 [16]. При моделировании системы использовался термостат Берендсена, давление поддерживалось равным 1 бар с помощью баростата Парринелло-Рахмана. Периодические граничные условия использовались во всех трех измерениях. Интегрирование уравнений движения проводилось по алгоритму leap-frog с шагом по времени 1 фс. Уравновешивание системы проводили примерно в течение 10 нс. Моделирование проводилось примерно 0,5 мкс. Полученные результаты анализировались с помощью встроенных утилит пакета Gromacs. В результате моделирования получили структуру эукариотического протонного транспортера, что позволило уточнить взаимодействие пермиазы Can1 с мембраной и молекулами воды. Были проанализированы 1712 мутации, нарушающие транспорт аналога аргинина канаванина в клетку и приводящие к устойчивости к этому фунгициду. Среди них отобрали 322 одиночные миссенс-мутации, инактивирующие фермент. Они локализовались в 158 а.о. Анализ их локализации позволяет уточнить механизмы функционирования аминокислотного транспорта.

1. Sato H. et al. J. Biol. Chem. 274, 11455 (1999).

2. Bannai S., Kitamuri E. J. Biol. Chem. 255, 2372 (1980).

3. Zimmermann N. et al. J. Clin. Invest. 111, 1863 (2003).

4. Yanagida O. et al. Biochim. Biophys. Acta 1514, 291 (2001).

5. Harada N. et al. Acta Haematol. 103, 144 (2000).

6. Blaesse P. et al. Neuron 61, 820 (2009).

7. McIntire S. L. et al. Nature 389, 870 (1997).

8. Chaudhry F., Reimer R., Edwards R., J. Cell Biol. 157, 349 (2002).

9. Opekarova M., Caspari T., Tanner W. Europ. J. Biochem. 211, 683 (1993).

10. Koltovaya N., Zhuchkina N., Dushanov E. Rus. J. Biol. Phys. Chem. 5, 644 (2020).

11. Koltovaya N., Dushanov E. Rus. J. Biol. Phys. Chem. 7, 565 (2022).

12. Gao X., Zhou L., Shi Y. Nature, 463, 828 (2010).

13. Kowalczyk L. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 108, 3935 (2011).

14. Ilgu H. et al. BMC Biology, 19, 179 (2021).

15. Jo S. et al. J. Comput. Chem., 29, 1859 (2008).

16. Van der Spoel D. et al. J. Comp. Chem., 26, 1701 (2005).

The superfamily of APC (amino acid-polyamine-orhanocation) transporters found in all living organisms and in humans consists of numerous families of solute carriers (SLC). The transport of amino acids across the cell membrane is carried out using secondary active transport and the glutathione transport system. Secondary active transport is the transfer of substrates using a concentration gradient of sodium or protons between the inner and outer sides of the cell membrane. Canonical APC transporters include the sodium-independent SLC7 glutamate/cysteine antiporter that exchanges extracellular cysteine for intracellular glutamate [1, 2]. Cationic amino acid transporters (CATs) are also members of the SLC7 family. They supply arginine for the synthesis of nitric oxide, which makes a major contribution to asthma pathogenesis [3]. In cancer, the APC L-type amino acid transporter I provides cells with the amino acids necessary for tumor cell growth, deregulates tumor cells [4], and mediates the uptake of melphalin, a chemotherapy drug [5]. In the central nervous system, the SLC12 transporters play an essential role in setting the concentration of Cl- and γ-amino butyric acid (GABA)- and glycine-mediated neurotransmission [6]. Other APC transporters are involved in a variety of biochemical processes in the nervous system, including the packing of inhibitory neurotransmitters in synaptic vesicles [7] and sodium- or proton-dependent symport of glutamine, a critical step in the recycling of glutamate and GABA [8]. To gain a deeper understanding of APC transporters in general and to understand the similarities and differences between proton-linked and sodium-linked transporters, we studied the atomic structure and mechanism of the eukaryotic proton-dependent yeast APC transporter.

The incorporation of amino acids into yeast cells is mediated by ~16 plasma membrane permiases, most of which belong to the APC superfamily of transporters. Arginine incorporation is carried out mainly by three permyases: Gap1, Can1, and Alp1, which work both as a transporter and as a receptor. The main amino acid permiase Gap1 transports all amino acids; Alp1 transports only arginine; Can1 transports arginine and, less efficiently, lysine. Can1 catalyzes H+/arginine symport, and arginine transport requires a proton driving force [9].

Yeast arginine permiase Can1 is a homodimer and consists of 590 a.a. The crystal structure of eukaryotic yeast permiases is missing from the PDB database, but there are atomic structures of three bacterial proteins of the APC family: antiporters arginine/agmatine (AdiC) and glutamate/γ-aminobutyric acid (GadC) and a broad specificity proton/amino acid symporter (ApcT). The proteins are similar in structure and consist of 12 alpha-helical transmembrane segments (TMs) flanking the hydrophilic tail directed into the cytoplasm. TMs form two “5+5” rings that span the substrate binding site. TM11 and TM12 carry out binding of monomers. Such stacking is typical of several families of transporters.

Previously [10, 11], for modeling, we used the crystal structure of the AdiC monomer (PDB: 3L1L and 3OB6) [12, 13] in an open conformation in an aqueous environment with arginine as a substrate. In this work, we used a high-resolution (1.7 Å) crystal structure of the AdiC homodimer (PDB: 7O82) embedded in a membrane hydrated with a 17 Å thick water layer as a basis for modeling Can1 [14]. This system was assembled using the CHARMM-GUI package [15]. Next, the system was balanced and simulated at a temperature of 310 K using Gromacs 2022.4 package [16]. When modeling the system, a Berendsen thermostat was used; the pressure was maintained at 1 bar using a Parrinello-Rahman barostat. Periodic boundary conditions were used in all three dimensions. The equations of motion were integrated using the leap-frog algorithm with a time step of 1 fs. The system was balanced for approximately 10 ns. The simulation was run for approximately 0.5 µs. The results obtained were analyzed using the built-in utilities of the Gromacs package. As a result of modeling, the structure of the eukaryotic proton transporter was obtained, which made it possible to clarify the interaction of the Can1 permease with the membrane and water molecules. We analyzed 1712 mutations that disrupt the transport of the arginine analogue canavanine into the cell and lead to resistance to this fungicide. Among them, 322 single missense mutations inactivating the enzyme were selected. They were localized in 158 a.a. Analysis of their localization makes it possible to clarify the mechanisms of functioning of amino acid transport.



1. Sato H. et al. J. Biol. Chem. 274, 11455 (1999).

2. Bannai S., Kitamuri E. J. Biol. Chem. 255, 2372 (1980).

3. Zimmermann N. et al. J. Clin. Invest. 111, 1863 (2003).

4. Yanagida O. et al. Biochim. Biophys. Acta 1514, 291 (2001).

5. Harada N. et al. Acta Haematol. 103, 144 (2000).

6. Blaesse P. et al. Neuron 61, 820 (2009).

7. McIntire S. L. et al. Nature 389, 870 (1997).

8. Chaudhry F., Reimer R., Edwards R., J. Cell Biol. 157, 349 (2002).

9. Opekarova M., Caspari T., Tanner W. Europ. J. Biochem. 211, 683 (1993).

10. Koltovaya N., Zhuchkina N., Dushanov E. Rus. J. Biol. Phys. Chem. 5, 644 (2020).

11. Koltovaya N., Dushanov E. Rus. J. Biol. Phys. Chem. 7, 565 (2022).

12. Gao X., Zhou L., Shi Y. Nature, 463, 828 (2010).

13. Kowalczyk L. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 108, 3935 (2011).

14. Ilgu H. et al. BMC Biology, 19, 179 (2021).

15. Jo S. et al. J. Comput. Chem., 29, 1859 (2008).

16. Van der Spoel D. et al. J. Comp. Chem., 26, 1701 (2005).