Бактерии для повышения выживаемости используют малые молекулы, позволяющие изменять стратегию развития: образовывать биоплёнки, переходить в покоящееся состояние при воздействии стрессовых факторов и др. Переход бактерий в подобные состояния сопровождается приобретением устойчивости к внешним воздействиям, что представляет собой серьёзную проблему в различных областях народного хозяйства и медицине. Одни из важных метаболитов бактерий, которые вырабатываются в цитоплазме к стационарной фазе роста бактериальной колонии – аутоиндукторы анабиоза, производные алкилрезорцинов. От их воздействия зависит регуляция перехода бактерий в покоящееся состояние [1]. Наиболее широко применяемым является химический аналог индукторов анабиоза – 4-гексилрезорцин (4ГР, 1,3-диокси-4-н-гексилбензол). Показано, что при внесении в питательную среду эффект зависит от дозы и стадии развития бактериальной колонии. Повышается стрессоустойчивость клеток, наблюдается переход в покоящееся либо мумифицированное состояние [2-3]. Дозозависимые эффекты обнаруживаются и при воздействии на белки [4] и ДНК [5-6] in vitro.

В настоящей работе методами молекулярной динамики исследована концентрационная зависимость и молекулярные механизмы взаимодействия 4ГР с биополимерами клетки Escherichia coli. Изучено воздействие 4ГР на внешнюю и внутреннюю мембраны, пептидогликан, мембранный белок порин, цитоплазматический ДНК-стабилизирующий белок Dps и ДНК. Расчёты в комплексе Gromacs с полноатомным силовым полем AMBER99-PARMBSC1. Постоянная температура (300 – 313 К) поддерживалась термостатом Ланжевена с постоянной трения 0.5 пс^-1. Постоянное давление – баростатом Парринелло-Рамана с постоянной времени 2 пс. Для систем ДНК, Dps и пептидогликана давление 1 атм. поддерживалось изотропным способом. При расчётах модельных мембран давление поддерживалось полуизотропным способом. Параметры взаимодействия связанных атомов и ближних взаимодействий рассчитывались для каждого временного шага. Электростатические взаимодействия на больших расстояниях рассчитывались методом суммирования по Эвальду (PME). Радиусы обрезания для всех типов взаимодействия брались равными 1.5 нм. Список соседей поддерживался с помощью схемы отсечки Верле и обновлялся каждые 10 фс. Быстрые степени свободы ограничивались с помощью алгоритма LINCS. Шаг интегрирования составлял 2фс (для пептидогликана – 1фс), длина траекторий – 0.1 мкс. Перед нахождением динамических характеристик ДНК и белков проводился анализ главных компонент. Для получения данных о свободной энергии миграции 4ГР через бислой использовались подходы управляемой молекулярной динамики и зонтичной выборки [2]. Для определения термодинамических характеристик связывания ДНК с Dps использовался метод поиска линейной энергии взаимодействия (LIE) с ранее подобранными параметрами [3].

Расчёты показали, что воздействие 4ГР не ограничивается каким-то определённым компартментом клетки, а характеризуется как комплексное влияние этого соединения на биополимеры оболочки бактериальной клетки и цитоплазмы. При миграции через мембраны 4ГР предпочтительно мигрирует через бислой, а не пориновые каналы. Он взаимодействует как с полисахаридными остатками внешней мембраны, так и с мембранными белками и липидами мембран. Толщина слоя 4ГР у наружной мембраны варьирует в зависимости от концентрации. Проникновение 4ГР в бислой, на границе порин–липиды, определяется его гидрофобным взаимодействием с трансмембранными участками белка порина. При прохождении наружной мембраны, 4ГР частично абсорбируется пептидогликаном, где остатки углеводов являются начальными связывающими сайтами. Во время роста такого комплекса, происходит изменение формы и размера пептидогликана за счёт того, что молекулы 4ГР переходят в область пептидов, порождая сжатие и растяжение. Молекулы 4ГР при взаимодействии с ДНК обладают способностью встраивать себя как в большую, так и малую бороздки с образованием связи O-H…O(-)-P (гидроксильной группой резорцина и фосфатной группой ДНК). Флуктуация атомов Dps значительно снижается присоединением ДНК. Способность адсорбции на поверхности Dps молекул 4ГР увеличивает или же понижает подвижность N-концов, при этом значительно возбуждаются колебания на внешней поверхсности ДНК, что ярко заметно при средних концентрациях 4ГР. Данные колебания имеют способность ускорять связывание ДНК. Методом поиска линейной энергии взаимодействия была получена свободная энергия связывания ДНК с Dps, которая изменяется от -49 кДж/моль (при отсутствии 4ГР), несколько увеличиваясь при малых концентрациях, но оставаясь отрицательной. до -150 кДж/моль (при больших концентрациях). Таким образом, эффект динамического поведения рассмотренных компонентов бактериальной клетки, зависит от способности 4ГР его претворять, при этом прямо обусловлен его концентрацией и хорошо согласуется с экспериментальными данными, где при малых и средних концентрациях ауторегулятора увеличивается стрессоустойчивость бактерий, а при больших концентрациях 4ГР образуются устойчивые, но нежизнеспособные формы.

Расчеты проводились на высокопроизводительной вычислительной системе МВС-10П в Межведомственном суперкомпьютерном центре Российской академии наук (МСЦ РАН). Работа выполнена в рамках Госзадания Минобрнауки России (FFZE-2022-0011, № 122040400089-6).

Литература:

1. Бухарин О. В., Гинцбург А. Л., Романова Ю. М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005.

2. Терешкин Э. В., Лойко Н. Г., Терешкина К. Б., Крупянский Ю. Ф. // Химическая физика. 2021. Т. 40 (11). С. 48.

3. Tereshkin E.V., Loiko N.G., Tereshkina K.B., Kovalenko V.V., Krupyanskii Y.F. // Russian Journal of Physical Chemistry B. 2022. V. 16. No. 4. P. 726. DOI: 10.1134/S1990793122040285

4. Кpупянcкий Ю.Ф., Нокc П.П., Лойко Н.Г. и др. // Биофизика. 2011. Т. 56. № 1. С. 13.

5. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В. и др. // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. C. 194

6. Давыдова О.К., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. C. 662

To obtain survival, bacteria use small molecules that change development parameters: the formation of biofilms, the transition to the initial state under the influence of stress factors, etc. The transition of pathogens to various states is accompanied by the acquisition of resistance to appearance, which is a serious problem in various states of the national economy and medicine . Some of them relate to metabolites that are produced in the cytoplasm by the stationary phase of growth of a bacterial colony - autoinducers of anabiosis, derivatives of alkylresorcinols. The regulation of bacterial infection transmission depends on their influence [1]. The most widely used chemical analog of suspended animation inducers is 4-hexylresorcinol (4HR). It has been shown that the effect depends on growth phases of bacterial colony. The stress sustainability of cells increases, it is observed in the presence or mummified state [2-3]. Dose-dependent effects are detected and in proteins [4] and DNA [5-6] in vitro.

In this work, the concentration dependence and molecular mechanisms of the interaction of 4HR with Escherichia coli cell biopolymers were studied by molecular dynamics methods. The effect of 4HR on the outer and inner membranes, peptidoglycan, membrane protein porin, cytoplasmic DNA-stabilizing protein Dps and DNA was studied. Simulations was carried out with Gromacs in all-atom force field AMBER99-PARMBSC1. A temperature was maintained by a Langevin thermostat with a friction coefficient of 0.5 ps^-1. Constant pressure was maintained by Parrinello-Raman barostat with a time constant of 2 ps. For DNA, Dps, and peptidoglycan systems, the pressure is 1 atm. maintained isotropically. When calculating model membranes, the pressure was maintained in a semi-isotropic way. The interaction parameters of bound atoms and short-range interactions were calculated for each time step. Electrostatic interactions at long distances were calculated by the Particle Mesh Ewald method (PME). The cutoff radii for all types of interaction were taken to be 1.5 nm. The list of neighbors was maintained using a Verlet cutoff scheme and updated every 10 fs. Fast degrees of freedom were limited using the LINCS algorithm. The integration step was 2 fs (for peptidoglycan, 1 fs), the trajectory length was 0.1 μs. Before finding the dynamic characteristics of DNA and proteins, a principal component analysis was performed. To obtain data on the free energy of 4HR migration through the bilayer, the approaches of controlled molecular dynamics and umbrella sampling were used [2]. To determine the thermodynamic characteristics of DNA binding to Dps, we used the method of searching for the linear interaction energy (LIE) with previously selected parameters [3].

Simulations showed that the effect of 4HR is not limited to any particular cell compartment, but is characterized as a complex effect of this compound on the biopolymers of the bacterial cell membrane and cytoplasm. When migrating across membranes, 4HR preferentially migrates through the bilayer rather than porin channels. It interacts both with polysaccharide residues of the outer membrane and with membrane proteins and membrane lipids. The thickness of the 4HR layer at the outer membrane varies depending on the concentration. Penetration of 4HR into the bilayer, at the porin–lipid interface, is determined by its hydrophobic interaction with the transmembrane regions of the porin protein. Upon passage through the outer membrane, 4GH is partially absorbed by peptidoglycan, where carbohydrate residues are the initial binding sites. During the growth of such a complex, a change in the shape and size of peptidoglycan occurs due to the fact that 4HR molecules pass into the region of peptides, causing compression and stretching. When interacting with DNA, 4HR molecules have the ability to insert themselves into both the major and minor grooves to form an O–H…O(–)–P bond (the hydroxyl group of resorcinol and the phosphate group of DNA). The fluctuation of Dps atoms is significantly reduced by the addition of DNA. The ability of 4HR molecules to adsorb on the Dps surface either increases or decreases the mobility of the N-termini, and vibrations are significantly excited on the outer surface of DNA, which is clearly noticeable at medium 4HR concentrations. These vibrations have the ability to accelerate DNA binding. The method of searching for the linear interaction energy was used to obtain the free energy of DNA binding to Dps, which varies from -49 kJ/mol (in the absence of 4HR), slightly increasing at low concentrations, but remaining negative. up to -150 kJ/mol (at high concentrations). Thus, the effect of the dynamic behavior of the considered components of the bacterial cell depends on the ability of 4HR to convert it, while being directly determined by its concentration and is in good agreement with experimental data, where at low and medium concentrations of the autoregulator, the stress resistance of bacteria increases, and at high concentrations of 4HR, stable, but unviable forms.

The computations were carried out on MVS-10P at Joint Supercomputer Center of the Russian Academy of Sciences (JSCC RAS). This work was supported within frameworks of the state task for FRC CP RAS FFZE-2022-0011 (#122040400089-6)

References:

1. Bukharin O. V. et al. The Mechanisms of Bacterial Survival, Moscow: Meditsina, 2005.

2. Tereshkin E. V. et al.// Russian Journal of Physical Chemistry B. 2021. V. 15 (6). P. 1026. https://doi.org/10.1134/S1990793121060099

3. Tereshkin E.V. et al.// Russian Journal of Physical Chemistry B. 2022. V. 16. No. 4. P. 726. DOI: 10.1134/S1990793122040285

4. Krupyanskii Y.F. et al.// Biophysics. 2011. V. 56. No. 1. P. 8.

5. Il'inskaia O.N. et al.// Mikrobiologiya. 2002. Т. 71. № 2. P. 194.

6. Davydova O.K. et al.// Microbiology (Mikrobiologiya). 2006. V. 75. № 5. P. 568.