Работа посвящена изучению серотонинергических компонентов в нервной системе свободноживущих планарий и паразитических плоских червей (Platyhelminthes). Планарии Schmidtea mediterranea являются модельным биологическим объектом, который используют при изучении молекулярных механизмов регенерационных процессов и функционирования стволовых клеток. Цестода Hymenolepis diminuta является опасным паразитом кишечника человека и животных.

В работе использовали S. mediterranea, размером около 1 мм (7 особей), а также личинок цестод (цистициркоидов) H. diminuta длиной 149–170 мкм и шириной до 99–106 мкм. Особей фиксировали 4% параформальдегидом, затем помещали в 15% раствор сахарозы. Для идентификации серотонина у планарий были использованы серийные замороженные срезы. Для исследования цестод H. diminuta использовали тотальные препараты (4 особи). Образцы окрашивали антителами к серотонину (Immunostar) непрямым иммуноцитохимическим методом и анализировали с помощью флуоресцентного Leica DM6000 B, и конфокального лазерного сканирующего (CLSM) микроскопов Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Германия) Сектора оптической микроскопии и спектрофотометрии ЦКП ПНЦБИ РАН. Измерения проводили на микрофотографиях с помощью программы AxioVision Rel 4.8.1.0. Измеряли размер нейронов. Количественная оценка серотониновых нейронов проводится впервые.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия препаратов, окрашенных антителами к серотонину, показала, что у H. diminuta нервная система представлена головными ганглиями, расположенными в головном конце между четырьмя присосками, и двумя парами нервных стволов, соединенных серотонин-иммунопозитивными (-ип) нервными комиссурами.

Локализацию серотониновой иммунореактивности наблюдали в телах нервных клеток и нервных волокнах в центральной нервной системе личинок H. diminuta. Серотонин-ип нервные элементы присутствовали в латеральных (или церебральных) ганглиях, в соединительной комиссуре, в хоботковых ганглиях, а также в продольных нервных стволах и в поперечных нервных комиссурах. Обнаружено, что пара серотонинергических нервов (хоботковые нервы) идет от латеральных ганглиев к хоботковым ганглиям, чтобы присоединиться к ним. В каждом из двух латеральных ганглиев идентифицировано несколько серотонин-ип нейронов. Всего в головном конце тела можно было наблюдать от 14 до 18 серотониновых нейронов.

Серотонин-ип нервные волокна присутствуют в нервных сплетениях внутри каждой присоски. Положительное окрашивание на серотонин наблюдается в нейритах, составляющих продольные нервные стволы, два из которых являются наиболее выраженными с расстоянием между ними около 50–64 мкм. Серотонинергические нейроны (в количестве 6–8) были обнаружены вдоль нервных стволов, которые соединены несколькими тонкими серотонин-ип нервными комиссурами.

Среднее значение размеров серотониновых нейронов у личинок H. diminuta составило: длина 4.80±0.28, ширина 3.53±0.34 мкм, (n=54, здесь и далее дано среднее арифметическое ± стандартное отклонение, n – число измерений). Средний размер серотониновых нейронов в передней трети тела личинки (головной конец) составил: длина 4.91±0.68, ширина 3.67±0.70 мкм (n=19).

У планарий S. mediterranea выявили обилие серотонин-ип нейронов и нервных волокон в центральных и периферических отделах нервной системы. Нервная система представлена головным нервным ганглием, имеющим форму дуги, и парой нервных стволов, простирающихся вдоль тела планарии. Число серотониновых нейронов в головном ганглии S. mediterranea, наблюдаемых на одном срезе, составило 25.7±3.1. Ширина дуги головного ганглия составила 109.2±15.3 мкм. Внутренняя часть головного ганглия состоит из тонких, окрашенных антителами к серотонину нервных волокон (так называемый «нейропиль»), тела же серотониновых нейронов у S. mediterranea расположены по периферии головного ганглия. Это в основном биполярные и мультиполярные, редко униполярные серотонин-ип нейроны. Средняя длина нейрона головного ганглия планарии 13.39±3.59 мкм, а ширина 9.34±2.42 мкм (n=120).

В периферических отделах нервной системы, а именно, в субмышечной нервной сети обнаружены многочисленные серотонин-ип нервные волокна и тела нейронов. Это в основном мультиполярные нейроны, реже биполярные, форма тел нейронов овальная, вытянутая, или неправильная. Размеры периферическиих нейронов планарий S. mediterrenea: длина 10.19±2.55 мкм, ширина 7.51±1.78 мкм (n=87).

Итак, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия совместно с иммуноцитохимической окраской тканей специфическими флуоресцентно мечеными антителами позволила идентифицировать и охарактеризовать серотониновые нейроны в нервной системе представителей паразитических и свободноживущих представителей плоских червей. Проведенное исследование позволило определить общее число, а также, локализацию и морфологические характеристики серотониновых нейронов центральной нервной системы планарий S. mediterranea и цестод H. diminuta. Морфометрические данные серотониновых нейронов, получены на большом числе измерений и приводятся впервые.

Результаты указывают на широкое распространение нейромедиатора серотонина у плоских червей. Обнаружено, что серотонинергические нейроны головного ганглия планарий являются более крупными, по сравнению с нейронами, расположенными в периферических отделах нервной системы. Число и размер нейронов планарий значительно превышает размеры нейронов у личинок паразитических цестод. Необходимо проведение исследований нервной системы с использованием большего числа видов для последующего сравнительного анализа морфометрических характеристик серотонин-ип компонентов нервной системы у свободноживущих и паразитических червей. Полученные сведения могут быть полезны для выявления и описания эволюционных закономерностей централизации нервной системы у билатерально симметричных организмов (Bilateria).

The study is dedicated to the investigation of serotonergic components in the nervous system of free-living planarians and parasitic flatworms (Platyhelminthes). Schmidtea mediterranea planarians are a biological model object that is used to study the molecular mechanisms of regenerative processes and the stem cells functioning. The cestode Hymenolepis diminuta is a dangerous intestinal parasite of a human and animals. Planarian S. mediterranea of about 1 mm in size (7 specimens) were used, as well as cestode larvae (the cysticircoids) of H. diminuta, 149–170 µm long and up to 99–106 µm wide. The specimens were flat fixed with 4% paraformaldehyde and then placed in a 15% sucrose solution. Serial frozen sections were used to identify serotonin in planarians. For the study of H. diminuta the whole-mount preparations (4 individuals) were used. Samples were stained by an indirect immunocytochemical method with primary antibodies to serotonin (Immunostar) and secondary fluorescently labeled immunoglobulines (Sigma), and analyzed using a Leica DM6000 B fluorescent microscope, as well as a Leica TCS SP5 confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems, Germany), Sector of Optical Microscopy and Spectrophotometry of the Center for Collective Use (ICB PSC RAS, Pushchino). The measurements were carried out on micrographs using the AxioVision Rel 4.8.1.0 software. The size of the neurons was measured. Quantitative evaluation of serotonin neurons is carried out for the first time.

A confocal laser scanning microscopy of preparations stained with antibodies to serotonin showed that the nervous system in H. diminuta is represented by the head ganglia located at the head end between four sucker, and by two pairs of the nerve cords connected by serotonin-immunopositive (-IP) nerve commissures. Localization of serotonin immunoreactivity was observed in the bodies of nerve cells and nerve fibers in the central nervous system of H. diminuta larvae. Serotonin-IP nerve elements were present in the lateral (or cerebral) ganglia, in the connective commissure, in the proboscis ganglia, as well as in the longitudinal nerve cords and in the transverse nerve commissures. A pair of serotonergic nerves is found to run from the lateral ganglia to the proboscis ganglia to join them. Several serotonin-IP neurons have been identified in each of the two lateral ganglia. In total, from 14 to 18 serotonin neurons could be observed at the head end of the body. Serotonin-IP nerve fibers are present in the nerve plexuses within each sucker. Positive staining for serotonin is observed in the neurites that comprise the longitudinal nerve cord, two of which are the most pronounced with a distance of about 50–64 µm between them. Serotonergic neurons (6–8) were found along the nerve cords, which are connected by several thin serotonin-IP nerve commissures. The average size of serotonin neurons in H. diminuta was: in length of 4.80±0.28 µm, in width 3.53±0.34 µm (n=54, hereinafter – the mean±standard deviation, n – number of measurements). The average size of serotonin neurons in the anterior 1/3 third (head end) of the larval body was: in length 4.91±0.68, in width 3.67±0.70 µm (n=19).

In S. mediterranea planarians, an abundance of serotonin-IP neurons and nerve fibers was found in the central and peripheral parts of the nervous system. The nervous system is represented by the head nerve ganglion, which has the shape of an arc, and a pair of ventral nerve cords extending along the planarian body. The number of serotonin neurons in the head ganglion of S. mediterranea observed on one tissue section was estimated as 25.7±3.1. The width of the head ganglion was 109.2±15.3 µm. The inner part of the head ganglion consists of thin nerve fibers stained with antibodies to serotonin (the so-called "neuropil"), while the bodies of serotonin neurons in S. mediterranea are located on the periphery of the ganglion. Mainly bipolar and multipolar, rarely unipolar serotonin-IP neurons were observed in the head ganglion. The average length of a neuron in the head ganglion of planarian is 13.39±3.59 µm, and its width is 9.34±2.42 µm (n=120). Numerous serotonin-IP nerve fibers and neuron cell bodies were found in the peripheral parts of the nervous system, namely, in the submuscular nerve network. These were mainly multipolar neurons, less often bipolar, the shape of the bodies of the neurons is oval, elongated, or irregular. Sizes of the peripheral serotonin neurons of planarian S. mediterrenea were: in length 10.19±2.55 µm, in width 7.51±1.78 µm (n=87).

Thus, a confocal laser scanning microscopy, together with the immunocytochemical staining of tissues with specific fluorescently labeled antibodies, made it possible to identify and characterize the serotoninergic neurons in the nervous system of representatives of parasitic and free-living flatworms. The study made it possible to determine the total number as well as the localization and morphological characteristics of serotonin neurons in the central nervous system of planarian S. mediterranea and cestoda H. diminuta.

Morphometric data on the serotoninergic neurons were obtained on a large number of measurements and are presented for the first time. The results point to the widespread distribution of the neurotransmitter serotonin in flatworms. It was found that the serotonergic neurons of the brain ganglion of planarians are larger than those located in the peripheral parts of the nervous system. The number and size of planarian neurons significantly exceeds the size of neurons in the larvae of parasitic cestodes. It is necessary to conduct studies of the nervous system using a larger number of species for subsequent comparative analysis of the morphometric characteristics of serotonin-IP components of the nervous system in free-living and parasitic worms. The information may be useful to reveal the evolutionary patterns of the centralization of the nervous system in Bilateria.