Исследования взаимодействий между малыми РНК, основная роль которых состоит в регуляции экспрессии множества генов, расширяют наши знания о их функциях. Различные методы показали способность ряда микроРНК (миРНК) образовывать гомодуплексы[1,2], т.е. дуплексы между самокомплементарными миРНК, с одинаковыми нуклеотидными последовательностями. Формирование дуплексов между миРНК, в составе которых повышается их устойчивость к деградации нуклеазами [2], может происходить при значениях минимальной свободной энергии (minimum free energy, MFE) ≤ –13 ккал/моль [2,3].Предположены неканонические функции гомодуплексов миРНК, т.е. вне участия миРНК в регуляции трансляции мРНК [2]. Виды, отличающиеся размерами геномов, процессируют различное количество миРНК - от десятков у некоторых вирусов до нескольких тысяч у млекопитающих. Вероятность формирования дуплексов увеличивается со снижением MFE [3],поэтому для интерпретации различий [2] в проценте (%) миРНК, способных образовывать гомодуплексы важен анализ изменений их уровня с ростом MFE. Целью этой работы был анализ распределения миРНК, способных образовывать гомодуплексы с различными MFE, у разных организмов. Оценивалась способность миРНК участвовать в регуляции процессинга на основе определения MFE для различных дуплексов. Для анализа взяты последовательности миРНК и премикроРНК( пре-миРНК) из базы miRBase, версия 22.1 , у разных видов: у домовой мыши (M. musculus), у человека (H. sapiens), и у 6 видов вирусов герпеса, инфицирующих H. sapiens - вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса герпеса 8 типа (HHV-8) , цитомегаловируса (HCMV) , вирусов герпеса 1 (HSV-1) и 2 типа (HSV-2), вируса герпеса 6B (HHV-6B). Биоинформатический анализ для выявления миРНК, способных образовывать гомодуплексы, и определения их MFE проводился c помощью программы RNAup, как описано ранее [3]. Определен % самокомплементарных миРНК при увеличении нижней границы диапазона образования гомодуплексов от ≤-13 до ≤-30 ккал/моль. Вероятность образования гетеродуплексов между миРНК и пре-миРНК определялась с помощью программы RNAhybrid 2.2 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/), наименьшее MFE было сопоставимо с ≤ –13 ккал/моль. Статистический анализ полученных данных проводился с помощью программы Statistica 10. Результаты и обсуждение: Корреляции данных расчета параметра MFE (в ккал/моль), полученные для гомодуплексов миРНК на основе метода, базирующегося на модели свободной энергии Тернера , Мэтьюза, и метода генерации ограничений [4] были высокими (коэффициент корреляции,R =0,97-0,98). Распределение миРНК, способных образовывать гомодуплексы показало, что для мыши и человека, продуцирующих большее количество– тысячи миРНК, процент из них самокомплементарных миРНК в диапазоне MFE от ≤-13 до ≤-17 был меньше ,чем у различных видов вирусов герпеса. Различие в % самокомплементарных миРНК между разными видами герпесов в этом диапазоне MFE сохранялось, что указывало на незначительное влияние погрешностей определения MFE [4] на результаты анализа. Обнаруженная неравномерность процентного содержания самокомплементарных миРНК при изменении MFE гомодуплексов дает возможность предполагать различное участии этих миРНК в регуляторных процессах. Сравнение данных из базы ViRmiRNA (http://crdd.osdd.net/servers/virmirna) не выявило отличий в количестве мРНК-мишеней для само- и не самокомплементарных миРНК (p>0,05). Некоторые миРНК, как и короткие олигонуклеотиды, могут участвовать в регуляции процессинга миРНК, связываясь с комплементарными последовательностями при-микроРНК и пре-миРНК [2,5]. Наш анализ показал, что у самокомплементарных миРНК вероятность образования гетеродуплексов больше. Большое количество сайтов гибридизации между самокомплементарными миРНК и разными премиРНК , по сравнению с не самокомплементарными миРНК у разных видов герпесов (различия достоверны по тесту U Манна-Уитни: для EBV- р<0,05, для HCMV - p<0,01, для HSV-1 - p<0,001, для HHV-8 - р<0,05) может указывать на больший вклад этих миРНК в регуляцию процессинга. Образование гомодуплексов с MFE≤-25 ккал/моль у мыши и человека для некоторых миРНК может способствовать накоплению этих миРНК в клетках, значительно снижая вероятность их выделения в экзосомах [3]. Причины относительного возрастания % самокомплементарных миРНК c MFE ≤-25 ккал/моль их гомодуплексов у мыши и человека могут быть выявлены в дальнейших исследованиях in vitro, учитывая возможность гибридизации миРНК и с другими типами некодирующих РНК.



ЛИТЕРАТУРА 1.Maiti M,Nauwelaerts K,Lescrinier E et al.//Biochem Biophys Res Commun.2010.392(4):572-76. 2.Belter A.,Gudanis D., Rolle K et al.// PLoS ONE.2014.9 (11). e113848/1–e113848/23.3.Кузьмичев С.А.,Комельков А.В.,ЧевкинаЕ.М //Рецепторы и внутриклеточная cигнализация.2019(1):48-53. 4.Andronescu M., Condon A., Hoos H.et al.//RNA.2010.16(12):2304-2318.5.Koralewska N., Hoffmann W., Pokornowska M et al.// Acta Biochim Pol. 2016;63(4):773-783.

The researches on interactions between small RNAs, whose main role is to regulate the expression of multiple genes, expands our knowledge of their functions. Various methods have shown the ability of a number of microRNAs (miRNAs) to form homo-duplexes [1,2], i.e. duplexes between self-complementary miRNAs, with the same nucleotide sequences. The formation of duplexes between miRNAs, which increase their resistance to nuclease degradation [2], can occur at minimum free energy (MFE) values ≤ –13 kcal/mol [2,3]. Non-canonical functions of miRNA homo-duplexes, i.e., outside the involvement of miRNA in the regulation of mRNA translation, has been suggested [2]. Species that differ in the size of genomes process different amounts of miRNA - from tens in some viruses to several thousand in mammals. The probability of duplex formation increases with a decrease in MFE [3], therefore, to interpret the differences [2] in the percentage (%) of miRNAs capable of forming homo-duplexes, it is important to analyze changes in their level with the increase of MFE. The aim of this work was to analyze the distribution of miRNAs capable of forming homo-duplexes with different MFEs in different organisms. The ability of miRNAs to participate in the regulation of processing based on the determination of MFE for different duplexes was evaluated. The miRNA and premicroRNA (pre-miRNA) sequences from the miRBase base, version 22.1, in different species were taken for analysis: in house mouse (M. musculus), in human (H. sapiens), and in 6 types of herpes viruses infecting H. sapiens - Epstein-Barr virus (EBV), herpes virus type 8 (HHV-8), cytomegalovirus (HCMV), herpes viruses 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2), herpes virus 6B (HHV-6B). Bioinformatic analysis for detecting miRNAs capable of forming homo-duplexes and determine their MFEs was carried out using the RNAup program as previously described [3]. It was determined of % of self-complementary miRNA with an increase in the lower limit of the homo-duplex formation range from ≤ -13 to ≤ -30 kcal/mol.The probability of hetero-duplex formation between miRNA and pre-miRNA was determined using RNAhybrid 2.2., (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/),the smallest MFE was comparable to ≤ -13 kcal/mol.Statistical analysis of the obtained data was carried out using the Statistica 10 program. Results and discussion:Correlations of MFE parameter calculation data (in kcal/mol) obtained for miRNA homoduplexes based on the Turner, Matthews free energy model method and constraint generation method [4] were high (correlation coefficient, R = 0.97-0.98).The distribution of miRNAs capable of forming homo-duplexes showed that for mice and human producing more than a thousand miRNAs, the percentage of these self-complementary miRNAs in the MFE range from ≤ -13 to ≤ -17 was less than in various types of herpes viruses. The difference in % of self-complementary miRNAs between different types of herpes was maintained in this range MFE, which indicated a slight effect of errors in the determination of MFE [4] on the analysis results. The observed non-uniformity of the percentage of self-complementary miRNAs in changing MFE homo-duplexes suggests different involvement of these miRNAs in regulatory processes. Comparison of data from the ViRmiRNA database (http://crdd.osdd.net/servers/virmirna) revealed no differences in the number of mRNA targets for self - and non-self-complementary miRNAs (p > 0.05).Some miRNAs, like short oligonucleotides, can participate in the regulation of miRNA processing by binding to complementary sequences of pri-microRNA and pre-miRNA [2,5]. Our analysis showed that self-complementary miRNAs are more likely to produce hetero-duplexes.A large number of hybridization sites between self-complementary miRNAs and different pre-miRNAs compared to non-self-complementary miRNAs in different herpes species (differences are significant for Mann-Whitney U test: for EBV- p < 0.05, for HCMV - p < 0.01, for HSV-1 - p < 0.001, for HHV-8 - p < 0.05) may indicate a greater contribution of these miRNAs to processing regulation. The formation of homo-duplexes with MFE≤ -25 kcal/mol in mice and human for some miRNAs may contribute to the accumulation of these miRNAs in cells, significantly reducing the likelihood of their isolation in exosomes [3]. The reasons for the relative increase in % of self-complementary miRNAs with MFE ≤ -25 kcal/mol of their homo-duplexes in mice and humans can be identified in further studies in vitro, given the possibility of miRNA hybridization and with other types of non-coding RNAs.



REFERENCES

1.Maiti M,Nauwelaerts K,Lescrinier E et al.//Biochem Biophys Res Commun.2010.392(4):572-76. 2.Belter A.,Gudanis D., Rolle K et al.// PLoS ONE.2014.9 (11). e113848/1-e113848/23.3.Kuzmichev S.A., Komelkov A.V., Tchevkina E.M.//Receptors and intracellular signaling 2019 (1): 48-53. 4.Andronescu M., Condon A., Hoos H.et al.//RNA.2010.16 (12): 2304-2318.5.Koralewska N., Hoffmann W., Pokornowska M et al .//Acta Biochim Pol 2016;63(4):773-783.