Предсказание возможных мишеней эпигенетической регуляции для миРНК, отличающихся нуклеотидными последовательностями, основывается не только на наличии комплементарных им нуклеотидных мотивов, но и на анализе параметров межмолекулярной гибридизации [1] , в том числе минимальной свободной энергии (minimum free energy, MFE). Особенности процессинга самокомплементарных миРНК, способных образовывать гомодуплексы, т.е. дуплексы между миРНК, имеющими одинаковые нуклеотидные последовательности, изучены не достаточно, учитывая , что содержание разных миРНК может изменяться в широких переделах в различных клетках [2].Для восполнения этого пробела нами были исследованы некоторые термодинамические параметры процессинга. Учитывая, что стабильность структуры дуплексов миРНК и премикроРНК (пре-миРНК) может влиять на скорость процессинга молекул миРНК рибонуклеазой РНКазой III Dicer [3], проведен сравнительный анализ параметра MFE фолдинга между пре-миРНК, с которых процессируются миРНК, имеющие разную MFE их гомодуплексов. Для анализа взяты последовательности миРНК и пре-миРНК из базы miRBase, версия 22.1 , у видов, отличающихся количеством продуцируемых миРНК: у вируса герпеса человека 1 типа (HSV-1)- 27 миРНК, у мухи дрозофилы ананасса (D. ananassae )- 74 миРНК, и у домовой мыши (M. musculus) – 1479 миРНК. Биоинформатический анализ для выявления миРНК, способных образовывать гомодуплексы и определения их MFE выполнен c помощью программы RNAup, как описано ранее [2]. Для вычисления MFE фолдинга премиРНК использовалась программа RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at). Статистический анализ полученных данных проводился с помощью программы Statistica 10. Результаты и обсуждение: Корреляции данных расчета параметра MFE (в ккал/моль), полученных для премиРНК и гомодуплексов миРНК на основе метода, базирующегося на модели свободной энергии Тернера , Мэтьюза, и метода генерации ограничений [1] были высокими (коэффициент корреляции,R =0,97-0,98). В тоже время, наш анализ показал, что с увеличением (по модулю) MFE гомодуплексов самокомплементарных миРНК от MFE ≥14-16 ккал/моль у 3-х видов (HSV-1, D. ananassae, M. musculus) из разных таксонов, значительно отличающихся в том числе по количеству генов и миРНК, достоверно возрастает MFE фолдинга их пре-миРНК (для HSV-1 – R =0,85, для M. musculus – R=0,6, для D. ananassae – R=0,58). Для домовой мыши анализ также показал отличие в распределении генов, кодирующих последовательности самокомплементарных миРНК, между разными хромосомами – с наибольшим количеством на 2, 7 и 12 хромосомах – 9%,11% и 10% ,соответственно, и наименьшем (порядка 1% ) на 3, 6 и 13 хромосомах. Корреляции между MFE гомодуплексов миРНК и MFE фолдинга их пре-миРНК на разных хромосомах у мыши тоже были достоверными. При снижении MFE пре-миРНК у них значительно возрастает содержание нуклеотидов G и С,что отражают высокие R (для HSV-1 – R =0,93, для M. musculus – R=0,8, для D. ananassae – R=0,82). Это согласуется с установленной ранее зависимостью между увеличением содержания G и С в пре-миРНК , и уменьшением их MFE, что позволяет образовывать более стабильную структуру пре-миРНК [4]. Обнаружено увеличение G и С в самокомплементарных миРНК, обладающих большей по модулю MFE гомодуплексов, однако здесь R были меньше (от 0,28 для M. musculus до 0,52 D. ananassae ), что указывает на влияние других пар нуклеотидов (A,U) на MFE гомодуплексов. Ранее показана возможность ингибирования процессинга некоторых пре-миРНК с помощью гибридизации c ними комплементарных им миРНК [5]. Увеличение количества G и С в пре-миРНК, с которых происходит процессинг самокомплементарных миРНК, по мере роста по модулю их MFE,предполагает возможность образования более высокоэнергетических вторичных структур (гетеродуплексов) пре-миРНК и комплементарных им миРНК. Последнее указывает на наличие механизма регуляции процессинга самокомплементарных миРНК по типу отрицательной обратной связи. Разные R между MFE гомодуплексов миРНК и MFE фолдинга пре-миРНК у разных видов указывают на то, что влияние нуклеотидной структуры их пре-миРНК на саморегуляцию процессинга миРНК может отличаться. Обнаруженная тенденция показывает возможность существования у разных видов молекулярного механизма, позволяющего увеличивать эффективность контроля процессинга пре-миРНК для самокомплементарных миРНК, способных образовывать более стабильные гомодуплексы.



ЛИТЕРАТУРА.

1.Andronescu M.,Condon A.,Hoos H.et al.//RNA.2010.16(12):2304-2318.2. Кузьмичев СА, Комельков АВ, Чевкина ЕМ // Успехи молекулярной онкологии. 2018. 5(3): 83-91. 3. Chakravarthy S., Sternberg S.H., Kellenberger C., Doudna J.F.//J Mol Biol . 2010.404(3): 392–402.4. Warris S.,Boymans S., Muiser I.,et al.//BMC Research Notes.2014.7 (34). 5.Koralewska N., Hoffmann W., Pokornowska M et al.// Acta Biochim Pol. 2016;63(4):773-783.

The prediction of possible targets of epigenetic regulation for miRNAs with different nucleotide sequences is based not only on the presence of nucleotide motifs complementary to them, but also on the analysis of intermolecular hybridization parameters [1], including minimum free energy (MFE). The peculiarities of processing self-complementary miRNAs capable of forming homo-duplexes, i.e. duplexes between miRNAs having the same nucleotide sequences, have not been sufficiently studied, taken into account that the content of different miRNAs can vary widely in various cells [2]. To fill this gap, we investigated some thermodynamic processing parameters. Considering that the stability of the structure of miRNA duplexes and premicroRNAs (pre-miRNAs) can affect the processing rate of miRNA molecules by Dicer RNase III [3], a comparative analysis of the MFE folding parameter was carried out between pre-miRNAs from which miRNAs having different MFE of their homo-duplexes are processed. The miRNA and pre-miRNA sequences were taken for analysis from the miRBase base, version 22.1, in species that differ in the amount of miRNA produced: in human herpes virus type 1 (HSV-1) - 27 miRNA, in Drosophila fly ananass (D. ananassae) - 74 miRNA, and in house mouse (M. musculus) - 1479 miRNA. Bioinformatic analysis for detecting miRNAs capable of forming homo-duplexes and determining their MFE was performed using the RNAup program, as described earlier [2]. RNAfold program was used to calculate the MFE of pre-miRNA folding (http://rna.tbi.univie.ac.at).Statistical analysis of the obtained data was carried out using the Statistica 10 program. Results and discussion: Correlations of MFE parameter calculation data (in kcal/mol) obtained for pre-miRNA and miRNA homoduplexes based on the Turner, Matthews free energy model method and constraint generation method [1] were high (correlation coefficient, R = 0.97-0.98). At the same time, our analysis showed that with an increase (absolute value) of MFE homo-duplexes of self-complementary miRNAs from MFE ≥14-16 kcal/mol in 3 species (HSV-1, D. ananassae, M. musculus) from different taxon, which differ significantly, including in the number of genes and miRNA, significantly increases the MFE of the folding of their pre-miRNA (for HSV-1 – R =0,85 , for M. musculus – R=0,6 , for D. ananassae – R=0,58). For the house mouse, the analysis also showed a difference in the distribution of genes encoding sequences of self-complementary miRNAs between different chromosomes - with the largest number on chromosomes 2, 7 and 12 - 9%, 11% and 10%, respectively, and the smallest (of the order of 1%) on 3.6 and 13 chromosomes. Correlations between MFE homo-duplexes of miRNA and MFE folding of their pre-miRNAs on different chromosomes in mice were also significant. With a decrease in MFE of pre-miRNAs in them significantly increase the content of nucleotides G and C, which reflect high R (for HSV-1 – R =0,93 , for M. musculus – R=0,8 , for D. ananassae – R=0,82). This is consistent with the previously established relationship between an increase in the content of G and C in pre-miRNA, and a decrease in their MFE, which allows the formation of a more stable pre-miRNA structure [4]. An increase in G and C was found in self-complementary miRNAs with greater absolute value MFE homo-duplex, but here the R were smaller (from 0.28 for M. musculus to 0.52 D. ananassae), which indicates the effect of other nucleotide pairs (A, U) on the MFE of homo-duplexes. Previously, the possibility of inhibiting the processing of some pre-miRNAs by hybridization with them complementary miRNAs has been shown [5]. The increase in the number of G and C in pre-miRNAs from which self-complementary miRNAs are processed, as they increase absolute value their MFE, suggests the possibility of forming more high-energy secondary structures (hetero-duplexes) of pre-miRNAs and complementary miRNAs. The latter indicates the presence of a mechanism for regulating the processing of self-complementary miRNAs by negative feedback loop. Different R's between MFE homo-duplexes of miRNA and MFE folding pre-miRNA in different species indicate that the effect of the nucleotide structure of their pre-miRNA on the self-regulation of miRNA processing may differ. The found tendency shows the possibility of a molecular mechanism in different species that allows increasing the efficiency of controlling pre-miRNA processing for self-complementary miRNAs capable of forming more stable homo-duplexes.



REFERENCES

1.Andronescu M.,Condon A.,Hoos H.et al.//RNA.2010.16(12):2304-2318.2.Kuzmichev S.A., Komelkov A.V., Tchevkina E.M.//2018. 5(3): 83-91. 3. Chakravarthy S., Sternberg S.H., Kellenberger C., Doudna J.F.//J Mol Biol.2010.404(3): 392–402.4. Warris S.,Boymans S., Muiser I.,et al.//BMC Research Notes.2014.7 (34). 5.Koralewska N., Hoffmann W., Pokornowska M et al.// Acta Biochim Pol. 2016;63(4):773-783.