Введение

Многие бактерии используют коммуникацию между клетками, называемую чувство кворума (quorum sensing), для координации изменений в поведении, зависящих от плотности популяции. Данное явление основано на секреции в окружающую среду и восприятии сигнальных молекул, концентрация которых изменяется в зависимости от количества окружающих клеток [Popat et al., 2015; Abisado et al., 2018]. Чувство кворума было обнаружено у морских бактерий [Zhao et al., 2019], дрожжей [Rosselló, Bouza, 2013], губок [Padder et al., 2018] и других видов одноклеточных, в частности, у микроводорослей [Zhang et al., 2021].

Диатомовые водоросли (Diatomeae) – это фотосинтезирующие водоросли, отличающиеся наличием «панциря» из диоксида кремния, называемого фрустулой, строение которой уникально для каждого вида, что делает их привлекательными для нанотехнологии [Rabiee et al., 2021]. Являясь важнейшей составляющей морского планктона, диатомеи создают до четверти всего органического вещества планеты [Белякова, 2006].

Интерес представляет космополитическая диатомовая водоросль Skeletonema costatum [Shevchenko et al., 2022], которая обитает в Чёрном море, биология и условия культивирования которой хорошо изучены [Kumar et al., 2014]. Геном S. costatum секвенирован, имеет в длину 51,13 Mb с GC-контентом 45,1%, экология и физиология описаны, что даёт понимание биологии этих организмов и может прояснить ряд прикладных вопросов. Например, как повысить выход биомассы при культивировании микроводрослей в искусственных условиях?

Биоинформационный анализ

У Thalassiosira pseudonana известны два специфичных для смерти белка: DSP1 и DSP2 (death-specific protein, DSP), что позволило найти ортологи у S. costatum, применяя процедуру pBLASTp к базе nr [Sayers et al., 2021]. Используя обе матрицы ABU86411.1 и ABU86412.1 из T. pseudonana, мы нашли протеиновые последовательности AAY27742.1 и ABU86410.1 в S. costatum. Дальнейший анализ протеинов AAY27742.1 и ABU86410.1 был проведён на сервере Protomenal [NOVEL, 2004], который позволяет выявлять функциональные домены. Оказалось, что оба белка содержат регуляторный EF-hand домен на C-конце полипептидной цепи, но отличаются по содержанию актуаторных доменов.

Математическое моделирование

Предположим, что активность белков, участвующих в процессах смерти у S. costatum, предотвращает тотальное вымирание при интенсивном росте, и возможно, лимитирует ростовые характеристики культур этих клеток в лабораторных условиях. Мы провели симуляционное моделирование в среде NetLogo [Wilensky, 1998, 1999; Liu, 2001]. Первоначально применили модели экспоненциального и логистического роста, входящие в список стандартных моделей NetLogo, которые используют системную динамику, где эксплуатируется идея лимитирования роста извне, например под действием неблагоприятных факторов среды или в результате истощения запасов питательных веществ. Тем не менее, как показывают наши данные о присутствии DSP генов в геноме S. costatum, внутренне управление предлагает возможность превентивной регуляции, которая могла возникнуть в ходе эволюции, как механизм, обеспечивающий надёжное выживание популяции в условиях быстро изменяющейся среды. Следовательно, логичнее каждую клетку представлять в виде автономного агента, настроенного на беспрерывное размножение, а также запрограммировать смерть в случае достижения порогового значения кворума или же выполнять симуляцию без граничных условий размножения, что соответствует отсутствию активности DSP белков в клетках. Симуляция начиналась с генерирования исходной случайной немногочисленной популяции агентов, ощущающих кворум. Размножение агентов сопровождалось выделением сигнальных молекул, при достижении максимальной локальной плотности которых происходит частичная гибель агентов, а потом повторяется всё с начала. Система устойчива на длительном интервале времени.

Заключение

Таким образом, при помощи биоинформационного анализа нами обнаружены 2 специфичных для смерти белка в диатомовой водоросли S. costatum. Имитационное агентно-ориентированное моделирование продемонстрировало устойчивый колебательный рост, регулируемый чувством кворума, а также безудержное экспоненциальное размножение при отключении внутренней регуляции. Молекулярно-биологические данные свидетельствуют, что в реальных бактериях и микроводорослях кворум-система осуществляет элиминацию клеток хозяина при помощи соответствующих DSP белков [Thamatrakoln et al., 2013; Hao et al., 2021], 2 из которых (AAY27742.1, ABU86410.1) мы обнаружили закодированными в геноме диатомовой водоросли S. costatum. Наши находки перекликаются с исследованиями на S. costatum [Chung et al., 2005, 2008] по авторегуляции численности этих организмов в условиях стресса. Выключение активности данных генов теоретические может привести к бесконтрольному росту культур при отсутствии лимита по питанию, что является интереснейшей находкой для крупномасштабного культивирования в биотехнологии. Практически это можно осуществить при помощи РНК-интерференции [Han, 2018] на уровне транскрипции или, что более практично, с помощью CRISPR/Cas9-таргетинга [Ma et al., 2014] соответствующих генов на уровне генома или с применением низкомолекулярных ингибиторов DSP белков с целью предотвратить автокаталитический лизис клеток.

Работа выполнена в рамках проекта Сириус.Лето «Трихоплакс для бионики III; от сенсоров к актуаторам» № 100220220512058031.

Introduction

Many bacteria use cell-to-cell communication to arrange population density-dependent changes in behavior, called quorum sensing. This phenomenon is based on the secretion into the environment and perception of signaling molecules, the concentration of which varies depending on the number of surrounding cells [Popat et al., 2015; Abisado et al., 2018]. Quorum sensing has been found in marine bacteria [Zhao et al., 2019], yeast [Rosselló and Bouza, 2013], sponges [Padder et al., 2018], and other single-cell species, particularly microalgae [Zhang et al., 2021].

Diatom algae (Diatomeae) are photosynthetic organisms characterized by the silica "shell," called a frustule, whose structure is unique to each species, making them attractive to nanotechnology [Rabiee et al., 2021]. Diatoms create up to a quarter of all organic matter on the planet as the most important component of marine plankton [Belyakova, 2006].

The cosmopolitan diatom Skeletonema costatum [Shevchenko et al., 2022], which inhabits the Black Sea and whose biology and cultivation conditions are well studied [Kumar et al., 2014], is of interest. The genome of S. costatum has been sequenced, is 51.13 Mb in length with a GC content of 45.1%, the ecology and physiology are described, which gives an understanding of the biology of these organisms and can clarify a number of applied questions. For example, how to increase the yield of biomass when culturing microalgae under artificial conditions?

Bioinformatics analysis

Two death-specific proteins are known in Thalassiosira pseudonana, such as DSP1 and DSP2 (death-specific protein, DSP), which allowed us to find orthologs in S. costatum by applying the pBLASTp procedure to the nr database [Sayers et al., 2021]. We found protein sequences AAY27742.1 and ABU86410.1 in S. costatum, using both matrices ABU86411.1 and ABU86412.1 from T. pseudonana. Further analysis of the AAY27742.1 and ABU86410.1 proteins was performed on the Protomenal server [NOVEL, 2004], which allows identification of functional domains. It turned out that both proteins contain a regulatory EF-hand domain at the C-terminus of the polypeptide chain, but differ in the actuator domains.

Mathematical modeling

Let the activity of proteins involved in death processes in S. costatum prevents total extinction during intensive growth, and possibly limits the growth characteristics of cultures of these cells under laboratory conditions. We performed simulations in the NetLogo environment [Wilensky, 1998, 1999; Liu, 2001]. Initially, we applied exponential and logistic growth models, which are included in the list of standard NetLogo models that use system dynamics, where the idea of growth limitation from outside, such as under the influence of unfavorable environmental factors or as a result of nutrient depletion, is exploited. Nevertheless, as our data on the presence of DSP genes in the S. costatum genome show, internal control offers the possibility of preventive regulation, which may have arisen during evolution as a mechanism ensuring the reliable survival of the population under rapidly changing environmental conditions. Consequently, it is more logical to represent each cell as an autonomous agent configured for uninterrupted reproduction, and to program death in case the quorum threshold is reached or to perform a simulation without reproduction boundary conditions, which corresponds to the absence of DSP protein activity in the cells. The simulation began by generating an initial random sparse population of quorum-sensing agents. Reproduction of the agents was accompanied by the release of signaling molecules, when their maximum local density was reached, partial death of the agents occurred, and then everything was repeated from the beginning. The system is stable over a long time interval.

Conclusion

Thus, we found 2 death-specific proteins in the diatom alga S. costatum by bioinformatic analysis. Agent-based simulations demonstrated sustained oscillatory growth regulated by quorum sensing, as well as unrestrained exponential growth when internal regulation was disabled. Molecular biological evidence suggests that the quorum system carries out host cell elimination in real bacteria and microalgae by means of DSP proteins [Thamatrakoln et al., 2013; Hao et al., 2021], 2 of which (AAY27742.1, ABU86410.1) we found encoded in the genome of the diatom alga S. costatum. Our finding is in agreement with the studies on S. costatum [Chung et al., 2005, 2008] on the autoregulation of the abundance of these organisms under stress. Turning off the activity of these genes theoretically can lead to uncontrolled growth of cultures in the absence of nutritional limits, which is a most interesting finding for large-scale cultivation in biotechnology. This can be realized by RNA interference [Han, 2018] at the transcriptional level or, more, by CRISPR/Cas9 targeting [Ma et al., 2014] of the relevant genes at the genome level, else by using low-molecular-weight DSP protein inhibitors to prevent autocatalytic cell lysis.

The work was performed as part of the Sirius.Summer project "Trichoplax for Bionics III; from Sensors to Actuators" No. 100220220512058031.