Трёхмерные многоклеточные конструкты, полученные in vitro, можно рассматривать как промежуточный уровень организации между отдельными клетками и сложными тканевыми структурами, представленными in vivo. Многоклеточные структуры всё чаще используются как для фундаментальных исследований, так и для практических приложений [1, 2]. Так, клеточные пласты являются многослойными плоскими, а сфероиды – сферическими самоорганизующимися многоклеточными структурами и простейшими моделями клеточных агрегатов, которые обладают развитыми межклеточными взаимодействиями и паракринной передачей сигналов, а также частично воссоздают структурную сложность нативных тканей, содержащих внеклеточный матрикс (ВКМ). И сфероиды, и клеточные пласты могут использоваться в тканевой инженерии в качестве бесскаффолдных конструктов, материала для биопечати, или в сочетании с различными скаффолдами [1, 2].

Многие предыдущие исследования были сконцентрированы на биологии многоклеточных структур, однако, очень мало данных доступно об их механических свойствах [3]. Понимание механического поведения таких структур является необходимым шагом для установления фундаментальных принципов тканевой биомеханики, тесно связанных с механизмами образования новых тканей, регенерации и развития патологий. Механические взаимодействия влияют на формирование клеточных агрегатов, процессы их перестройки и слияния, а также на жизнеспособность и функционирование отдельных клеток в их составе. Настройка механических свойств является многообещающим путем для управления данными процессами.

Одним из доступных методов изучения механических свойств клеток и ВКМ является атомно-силовая микроскопия (АСМ) [4], которая позволяет оценивать локальные вязкоупругие свойства материалов на наноразмерном масштабе. Однако, метод АСМ ограничен поверхностным слоем клеток, тогда как оценка вклада элементов ВКМ в механику сформировавшихся клеточных конструктов требует методов с большей степенью деформации материала. К таким макроскопическим методам относятся сдавливание или растяжение конструкта как целого. Объединение данных, полученных разномасштабными методами, требует применения определенных механических моделей, способных описать биомеханическое поведение конструктов на разных масштабах.

В данной работе использовали линии фибробластов мыши и крысы, а также мезенхимальные стромальные и эпителиальные клетки человека. С помощью одновременного наблюдения за морфологией и механикой на уровне единичных клеток и многоклеточных конструктов с помощью АСМ, были получены данные, свидетельствующие о релаксации напряжений в цитоскелете в процессе открепления клеток от субстрата и формирования пласта. Был также применен метод микроиндентации, показавший, что роль ВКМ может расти с увеличением времени культивирования клеточного пласта.

Для изучения сфероидов, помимо АСМ, был применен метод сжатия между пластинами. Сравнение данных двух этих методов позволило установить эффективное поверхностное натяжение сфероида, а также роль ВКМ при макроскопической деформации. Для описания биомеханики сфероидов были использованы механические модели упругого тела с поверхностным натяжением, вязкоупругого и пороэластичного тел, чья комбинация позволила описать разницу в механическом поведении сфероидов из двух различных типов клеток, мезенхимальных и эпителиальных. Сфероиды из мезенхимальных клеток имели большее поверхностное натяжение и более плотную укладку ВКМ во внутренней части, что проявлялось в более высокой жесткости поверхности по данным АСМ и больших временах релаксации при сжатии между пластинами [5]. Полученные результаты будут способствовать более детальному описанию биомеханики клеточных пластов, сфероидов и тканей, а также могут найти применение в моделировании процессов формирования клеточных пластов, слияния сфероидов и для управления их механическими свойствами.

Исследования выполнены при поддержке гранта РНФ 21-15-00349.



Литература

1. I.M. Zurina, V.S. Presniakova, D. V. Butnaru, A.A. Svistunov, P.S. Timashev, Y.A. Rochev, Tissue engineering using a combined cell sheet technology and scaffolding approach, Acta Biomater. 113 (2020) 63–83.

2. X. Cui, Y. Hartanto, H. Zhang, Advances in multicellular spheroids formation, J. R. Soc. Interface. 14 (2017) 20160877.

3. Y.M. Efremov, I.M. Zurina, V.S. Presniakova, N. V. Kosheleva, D. V. Butnaru, A.A. Svistunov, Y.A. Rochev, P.S. Timashev, Mechanical properties of cell sheets and spheroids: the link between single cells and complex tissues, Biophys. Rev. 13 (2021) 541–561.

4. P.K. Viji Babu, C. Rianna, U. Mirastschijski, M. Radmacher, Nano-mechanical mapping of interdependent cell and ECM mechanics by AFM force spectroscopy, Sci. Rep. 9 (2019) 1–19.

5. Kosheleva, N. V., Efremov, Y. M., Koteneva, P. I., Ilina, I. V., Zurina, I. M., Bikmulina, P. Y., ... & Timashev, P. S. (2022). Building a tissue: Mesenchymal and epithelial cell spheroids mechanical properties at micro-and nanoscale. Acta Biomaterialia. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.09.051

Three-dimensional multicellular constructs obtained in vitro can be considered as an intermediate level of organization between individual cells and complex tissue structures presented in vivo. Multicellular structures are increasingly used for both fundamental research and practical applications [1, 2]. For example, cell sheets are multilayer and flat, while spheroids are spherical, and both are self-organizing multicellular structures and the simplest models of cell aggregates that have developed intercellular interactions and paracrine signaling, and also partially recreate the structural complexity of native tissues containing an extracellular matrix (ECM). Both spheroids and cell sheets can be used in tissue engineering as scaffold-free constructs, material for bioprinting, or in combination with various scaffolds [1, 2].

Many previous studies have focused on the biology of multicellular structures; however, very little data is available on their mechanical properties [3]. Understanding the mechanical behavior of such structures is a necessary step to establish the fundamental principles of tissue biomechanics, which are closely related to the mechanisms of new tissue formation, regeneration, and development of pathologies. Mechanical interactions affect the formation of cell aggregates, the processes of their rearrangement and fusion, as well as the viability and functioning of individual cells in their composition. Mechanical property tuning is a promising way to control these processes.

One of the available methods for studying the mechanical properties of cells and ECM is atomic force microscopy (AFM) [4], which is used to evaluate the local viscoelastic properties of materials on a nanoscale. However, the AFM method is limited to the surface layer of cells, while the assessment of the contribution of ECM elements to the mechanics of the formed cell constructs requires methods with a greater degree of material deformation. Such macroscopic methods include squeezing or stretching the construct as a whole. Combining data obtained by different scale methods requires the use of certain mechanical models that can describe the biomechanical behavior of constructs at different scales.

In this work, we used mouse and rat fibroblast lines, as well as human mesenchymal stromal and epithelial cells. With the help of simultaneous monitoring of morphology and mechanics at the level of single cells and multicellular constructs using AFM, data were obtained indicating the relaxation of stresses in the cytoskeleton during the detachment of cells from the substrate and formation of the cell sheet. The method of microindentation was also used, which showed that the role of ECM can increase with an increase in the time of cultivation of the cell sheet.

To study spheroids, in addition to AFM, the method of compression between plates was used. Comparison of the data of these two methods made it possible to establish the effective surface tension of the spheroid, as well as the role of the ECM in macroscopic deformation. To describe the biomechanics of spheroids, mechanical models of an elastic body with surface tension, viscoelastic and poroelastic bodies were used, whose combination made it possible to describe the difference in the mechanical behavior of spheroids from two different types of cells, mesenchymal and epithelial. The spheroids from mesenchymal cells had a higher surface tension and a denser packing of the ECM in the inner part, which manifested itself in a higher surface rigidity according to AFM data and longer relaxation times during compression between the plates [5]. The results obtained will contribute to a more detailed description of the biomechanics of cell sheets, spheroids, and tissues, and can also be used in modeling the processes of cell sheet formation, fusion of spheroids, and to control their mechanical properties.

The research was supported by the Russian Science Foundation grant 21-15-00349.



References

1. I.M. Zurina, V.S. Presniakova, D. V. Butnaru, A.A. Svistunov, P.S. Timashev, Y.A. Rochev, Tissue engineering using a combined cell sheet technology and scaffolding approach, Acta Biomater. 113 (2020) 63–83.

2. X. Cui, Y. Hartanto, H. Zhang, Advances in multicellular spheroids formation, J. R. Soc. Interface. 14 (2017) 20160877.

3. Y.M. Efremov, I.M. Zurina, V.S. Presniakova, N. V. Kosheleva, D. V. Butnaru, A.A. Svistunov, Y.A. Rochev, P.S. Timashev, Mechanical properties of cell sheets and spheroids: the link between single cells and complex tissues, Biophys. Rev. 13 (2021) 541–561.

4. P.K. Viji Babu, C. Rianna, U. Mirastschijski, M. Radmacher, Nano-mechanical mapping of interdependent cell and ECM mechanics by AFM force spectroscopy, Sci. Rep. 9 (2019) 1–19.

5. Kosheleva, N. V., Efremov, Y. M., Koteneva, P. I., Ilina, I. V., Zurina, I. M., Bikmulina, P. Y., ... & Timashev, P. S. (2022). Building a tissue: Mesenchymal and epithelial cell spheroids mechanical properties at micro-and nanoscale. Acta Biomaterialia. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.09.051