Ранее показано, что IP3R-зависимые медленные сигналы Ca2+ могут участвовать в активации специфических транскрипционных программ мышечных волокон. Цель работы: проверка гипотезы об участии IP3R и PI3K в развитии атрофических процессов в скелетных мышцах на ранних этапах функциональной разгрузки. Мы также впервые исследовали, имеет ли влияние передача АТФ-опосредованных сигналов в мышце in vivo при функциональной разгрузке на активацию кальций-зависимых сигнальных путей и экспрессию рецепторов инозитол 1,4,5 трифосфата (IP3R). Для этого мы провели эксперимент с 3-дневным вывешиванием крыс и ингибированием киназы PI3 (PI3K). PI3K катализирует фосфорилирование фосфатидилинозитолдифосфата (PIP2), давая PIP3 высоко заряженный остаток, который рекрутирует фосфолипазу C (PLC) в мембрану, запуская гидролиз PIP2 на диацилглицерин и IP3. IP3 связывается с IP3R, присутствующими как в ядерной оболочке, так и в саркоплазматической сети, вызывая слабый сигнал высвобождения кальция, как в цитозоле, так и нуклеоплазме, что способствует активации факторов транскрипции, приводящих к экспрессии или репрессии генов, вовлеченных в фенотип мышечных клеток. При функциональной разгрузке мышц концентрация кальция в миоплазме существенно возрастает. Если наша гипотеза верна, то воздействие на IP3R при ингибировании PI3K во время функциональной разгрузке мышц предотвратит, или существенно снизит экспрессию ключевых мышечных Е3-лигаз MuRF1 и MAFbx и будет препятствовать активации транскрипционных факторов, влияющих на фенотип мышц.

Для проведения эксперимента были взяты 24 самца крыс линии Wistar и распределены на 3 группы по 8 крыс в каждой: контроль группа с введением плацебо (С); группа 3-суточного антиортостатического вывешивания с введением плацебо (HS); группа 3-суточного антиортостатического вывешивания с введением ингибитора PI3K LY294002 (LY, 30 мг/кг веса животного, внутрибрюшинно). Эксперимент был одобрен комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ — ИМБП РАН (протокол №617) и соответствует современным нормам и стандартам работы с животными.

Мышцы m.soleus крыс, вывешенных без введения препарата, подверглись существенной атрофии по сравнению с группой контроля (на 33%, p<0,05). Вес мышц в группе с введением препарата был достоверно выше, чем в группе вывешивания с введением плацебо. Уровень АТФ в группе с введением ингибитора LY не отличался от группы С, тогда как в группе вывешивания был повышен на 24% (p<0,05). Уровень pAMPK в m.soleus в группе LY также не отличался от группы контроля в то время, как в группе, вывешенной без препарата (HS), он был снижен на 37%. Содержание IP3R увеличивается при вывешивании на 41% относительно контроля (p<0,05), а введение препарата предотвращает эти изменения. Мы измерили содержание маркеров кальций-зависимой передачи сигналов ¬– CaMK IIb и CaN. Фосфорилирование CaMKII было увеличено на 59% (p<0,05) в ненагруженной камбаловидной мышце (гр. HS) относительно группы контроля, однако введение ингибитора PI3K предотвратило эти изменения. Аналогичные результаты получены для кальцинейрина. Его экспрессия в m.soleus группы LY была ниже на 16%, чем в группе, вывешенной без препарата (p<0,05).

В группе HS уровень экспрессии мРНК Е3-лигаз MuRF1 и MAFbx, а также убиквитина был существенно выше (на 82, 137 и 158% соответственно, p<0,05), чем в группе контроля. Введение ингибитора PI3K полностью предотвратило повышение экспрессии мРНК MuRF1 в группе LY, и существенно снизило в ней экспрессию MAFbx и убиквитина (на 22 и 119% соответственно относительно группы вывешивания без препарата, p<0,05). В группе с введением ингибитора LY при вывешивании уровень маркёров белкового синтеза IRS-1, 4E-BP, фосфорилирование рибосомного белка S6 – не отличались от уровня группы контроля в то время, как в группе HS эти параметры были существенно снижены (на 34, 15 и 55 (для pS6(Ser235/236) и 83% (для pS6(Ser240/244) соответственно), p<0,05).

Итак, ингибирование фосфоинозитид-3-киназы при функциональной разгрузке m.soleus предотвращает накопление в ней АТФ, замедляет атрофию m.soleus, а также экспрессию Е3 лигаз и убиквитина, предотвращает повышение содержания IP3-рецепторов, регулирует активность кальций-зависимых сигнальных путей ¬– снижает экспрессию мРНК CaN и фосфорилирование CaMKII; влияет на регуляцию маркеров анаболической передачи сигналов – предотвращает снижение фосфорилирования 4E-BP, рибосомного белка S6; а также предотвращает снижение скорости элонгационных процессов, предотвращая фосфорилирование eEF2.

Работа выполнена при финансировании гранта РНФ № 21-15-00228

It was shown that IP3R-dependent slow Ca2+ signals may be involved in the activation of specific transcriptional programs in muscle fibers. Objective: to test the hypothesis about the involvement of IP3R and PI3K in the development of atrophic processes in skeletal muscles at early stages of functional unloading. We also investigated for the first time whether in vivo ATP-mediated muscle signalling during functional unloading affects the activation of calcium-dependent signalling pathways and the expression of inositol 1,4,5 triphosphate receptors (IP3R). We conducted an experiment with 3-day suspension of rats and PI3 kinase (PI3K) inhibition. PI3K catalyzes the phosphorylation of phosphatidylinositol diphosphate (PIP2), giving PIP3 a highly charged residue that recruits phospholipase C (PLC) to the membrane, triggering the hydrolysis of PIP2 into diacylglycerol and IP3. IP3 binds to IP3Rs, which present in the nuclear envelope and in the sarcoplasmic reticulum, causing a weak calcium release signal, both in the cytosol and nucleoplasm, which promotes the activation of transcription factors leading to changes in expression of genes involved in the phenotype of muscle. With functional unloading of muscles, the concentration of calcium in the myoplasm significantly increases. If our hypothesis is correct, then affecting IP3R by inhibiting PI3K during functional unloading will prevent or significantly reduce the expression of key muscle E3 ligases MuRF1 and MAFbx and will prevent the activation of transcription factors that affect the muscle phenotype.

For the experiment, 24 male Wistar rats were divided into 3 groups of 8 animals each: control group with placebo (C); 3-day hindlimb suspension with placebo (HS); group of 3-day hindlimb suspension with the administration of the PI3K inhibitor LY294002 (LY, 30 mg/kg, intraperitoneally). Experiments were performed at the Institute of Biomedical Problems, RAS, Russia. The experiments were approved by the Committee on Bioethics of the Russian Academy of Sciences (protocol No. 617). The study was conducted in accordance with the internationally accepted regulations and rules of biomedical ethics.

Soleus muscles of rats suspended without drug administration underwent significant atrophy compared with the control group (by 33%, p<0.05). The weight of the muscles in the group with the administration of the LY was significantly higher than in HS group. The ATP level in the LY inhibitor group did not differ from group C, while it was increased by 24% in the HS group (p<0.05). The level of pAMPK in m.soleus in the LY group also did not differ from the control group, while it was reduced by 37% in the untreated (HS) group. The content of IP3R increases by 41% when suspended compared to the control (p<0.05), and the administration of the LY prevents these changes. We measured the content of markers of calcium-dependent signaling –CaMKII and CaN. Phosphorylation of CaMKII was increased by 59% (p<0.05) in unloaded soleus muscle (gr. HS) compared with the control group, however, administration of a PI3K inhibitor prevented these changes. Similar results were obtained for calcineurin. Its expression in the m.soleus of LY group was 16% lower than in the group suspended with placebo (p<0.05).

In HS group, the level of mRNA expression of E3-ligases MuRF1 and MAFbx, as well as ubiquitin, was significantly higher (by 82, 137 and 158%, respectively, p<0.05) than in the control group. The administration of the PI3K inhibitor completely prevented the increase in the expression of MuRF1 mRNA in LY group, and significantly reduced the expression of MAFbx and ubiquitin in it (by 22 and 119%, respectively, relative to HS group, p<0.05). In the group with the administration of the LY inhibitor during suspension, the level of protein synthesis markers IRS-1, 4E-BP, phosphorylation of ribosomal protein S6 did not differ from the level of the control group, while in HS group these parameters were significantly reduced (by 34, 15 and 55 (for pS6(Ser235/236) and 83% (for pS6(Ser240/244) respectively), p<0.05).

Thus, inhibition of phosphoinositide-3-kinase during functional unloading of m.soleus prevents the accumulation of ATP, slows down atrophy of m.soleus, as well as the expression of E3 ligases and ubiquitin, prevents an increase in the content of IP3 receptors, regulates the activity of calcium-dependent signalling pathways – reduces CaN mRNA expression and CaMKII phosphorylation; affects the regulation of markers of anabolic signaling – prevents a decrease in phosphorylation of 4E-BP, ribosomal protein S6; and also prevents a decrease in the rate of elongation processes by preventing eEF2 phosphorylation.

This work was supported by the Russian Science Foundation No. 21-15-00228