При длительной гипокинезии, гравитационной разгрузке, иммобилизации конечности, а также при длительном лишении человека обычной двигательной активности скелетные мышцы подвергаются атрофии в результате нарушающегося баланса между синтезом и деградацией белка. Мы предположили, что АТФ и «медленный» Са2+ могут стимулировать запуск этих процессов. В скелетных мышцах деполяризующие стимулы индуцируют как быстрый сигнал кальция, связанный с сокращением, так и медленный сигнал, который регулирует экспрессию генов. Накапливающийся в цитоплазме мышечных волокон кальций активно откачивается в саркоплазматический ретикулум с помощью «насоса» SERCA. Это активный процесс, т.к. кальций закачивается в саркоплазматический ретикулум против градиента концентрации, и для этого используется кальций-зависимый гидролиз АТФ. Мы предположили, что при функциональной разгрузке SERCA инактивируется, из-за чего кальций может накапливаться в цитоплазме и активировать катаболические сигнальные пути.

Для проверки гипотезы о роли снижения активности SERCA при ограничении функциональной активности мышц в регуляции клеточных сигнальных путей и снижении сократительных характеристик мышц был применён CDN1163 (специфический активатор SERCA) в модели функциональной разгрузки. При моделировании функциональной разгрузки скелетных мышц использовалась методика Ильина-Новикова в модификации Morey–Holton. Для эксперимента были взяты 24 самца крыс линии Wistar, которые были разделены на 3 группы по 8 животных в каждой: С – контроль; HS – трехдневное вывешивание; CDN – трехдневное вывешивание с введением CDN1163 (50 мг/кг веса животного, внутрибрюшинно). Эксперимент был одобрен комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ — ИМБП РАН (протокол №584) и соответствует современным нормам и стандартам работы с животными.

После 3 суток вывешивания в группе HS мы обнаружили достоверное снижение веса камбаловидной мышцы относительно группы C, однако в группе CDN снижение было меньше, чем в гр. без препарата HS (p<0,05). Содержание АТФ в группе HS было на 24% выше, чем в гр.С (p<0,05). Введение активатора SERCA в группе 3CDN предотвратило эти изменения. При вывешивании на фоне накопления АТФ наблюдается тенденция к снижению фосфорилирования AMPK. При этом в группе CDN, где предотвращено накопление АТФ, наблюдается увеличение фосфорилирования AMPK в два раза по сравнению с вывешиванием без введения препарата, указывая на корреляцию активности AMPK и накопления АТФ. Так как SERCA регулирует содержание ионов кальция в миоплазме, было определено содержание ведущих маркёров кальций-зависимых сигнальных путей. В группе HS наблюдалось увеличение фосфорилирования CaMKII на 204% и содержания IP3R на 41% относительно группы контроля (p<0,05). Введение CDN на фоне вывешивания предотвращает увеличение фосфорилирования CaMKII и содержания IP3R. Ранее показано, что IP3R-зависимые медленные сигналы Ca2+ могут участвовать в активации специфических транскрипционных программ фенотипа медленных и быстрых мышечных волокон.

Мы оценили уровни экспрессии ключевых в атрофическом процессе убиквитина и Е3-убиквитинлигаз. Экспрессия мРНК убиквитина и E3-убиквитинлигаз MuRF1, MAFbx и Cbl-b была существенно повышена в группе HS относительно контроля на 158, 37, 136 и 101% соответственно. Введение препарата при 3-х дневном вывешивании предотвратило увеличение экспрессии мРНК MurF1 (но не MAFbx) и существенно снизила увеличение экспрессии Cbl-b и убиквитина в группе с введением препарата (CDN) (p<0,05). Экспрессия Е3-убиквитинлигаз может регулироваться несколькими транскрипционными факторами, например, MYOG, FOXO3. Уровень фосфорилирования FoxO3 был одинаково снижен во всех вывешенных группах (HS и CDN) относительно группы контроля. Экспрессия MYOG была повышена в группе HS на 14% относительно контроля (p<0,05). В группе CDN уровень мРНК MYOG не отличался от группы контроля. Таким образом, предотвращение экспресии E3-лигазы MuRF1 при введении активатора SERCA связано со снижением транскрипционной активности миогенина.

Анализ маркеров анаболического сигналлинга показал, что уровень фосфорилирования p-p70S6K не менялся при 3-х дневном вывешивании крыс, а фосфорилирование 4Е-BP и P90RSK было одинаково снижено в обеих вывешенных группах – HS и CDN. Однако, фосфорилирование сайтов рибосомного белка S6 (Ser240/244) и (Ser235/236) было снижено только в группе HS на 83 и 55% соответственно по сравнению с контролем (p<0,05), а введение препарата предотвратило это снижение. Уровень фосфорилирования eEF2 растет на 148% в группе HS по сравнению с контрольной группой, что снижает скорость процессов элонгации в ненагруженных мышцах. Введение активатора SERCA полностью предотвратило увеличение фосфорилирования eEF2. GSK-3b может регулировать как анаболические, так и протеолитические процессы, поскольку является эндогенным ингибитором синтеза белка и промотором деградации белка. Мы обнаружили снижение фосфорилирования GSK-3b в группе HS на 26% относительно группы контроля (p<0,05), которое было полностью предотвращено введением CDN1163.

Вывод: при 3-дневной функциональной разгрузке m. soleus введение активатора SERCA не влияло на маркёры mTORC1-зависимого сигналлинга, но предотвращало снижение фосфорилирования анаболических маркёров – GSK3b, eEF2 и белка S6 малой субъединицы рибосомы, что в совокупности могло способствовать улучшению эффективности трансляции. Транскрипционные факторы FoxO3 и MYOG активируются при функциональной разгрузке m. soleus, но к регуляции экспрессии Е3 лигаз MurF1 и Cbl-b при активировании SERCA может иметь отношение MYOG. Активатор SERCA CDN1163 влияет на регуляцию Ca-зависимых сигнальных путей при мышечной разгрузке, через изменение фосфорилирования CaMKII и уровня IP3R.

Работа выполнена при финансировании гранта РНФ № 21-15-00228

With prolonged hypokinesia, gravitational unloading, limb immobilization, as well as with a long-term absence of normal motor activity, skeletal muscles undergo atrophy as a result of an imbalance between protein synthesis and degradation. We assumed that ATP and “slow” Ca2+ stimulate the start of processes. In skeletal muscle, depolarizing stimuli induce a fast metabolic signal associated with contraction as well as a slow signal that regulates gene expression. The calcium accumulating in the cytoplasm of muscle tissues is actively pumped out to the sarcoplasmic reticulum using the SERCA. This is an active process because calcium is pumped into the sarcoplasmic reticulum against a concentration gradient, and calcium-dependent ATP hydrolysis is used for it. We hypothesized that during functional unloading, SERCA is inactivated, due to which calcium can accumulate in the cytoplasm and activate catabolic signaling pathways.

CDN1163 (a specific SERCA activator) was used to test the hypothesis of SERCA activity in the regulation of cellular signaling pathways and a decrease in muscle contractile characteristics with limited functional muscle activity. Hindlimb suspension was performed using a traction method of noninvasive tailcasting. With this method of unloading rats are free to move around the cage using forelimbs and have food and water ad libitum. For the experiment, 24 male Wistar rats were divided into 3 groups of 8 animals each: C - control; HS - three-day of hindlimb suspension with placebo; CDN - three-day hindlimb suspension with CDN1163 (50 mg/kg, intraperitoneally). Experiments were performed at the Institute of Biomedical Problems, RAS, Russia. The experiments were approved by the Committee on Bioethics of the Russian Academy of Sciences (protocol 584). The study was conducted in accordance with the internationally accepted regulations and rules of biomedical ethics.

After 3 days of unloading in HS group, a decrease in the weight of the soleus muscle compared with C was revealed, however, in CDN group, the decrease was less than in HS gr. (p<0.05). The ATP content in the HS group was 24% higher than in group C (p<0.05). SERCA activator in 3CDN group prevented these changes. With the accumulation of ATP during suspension, a tendency to a decrease in AMPK phosphorylation. At the same time, in CDN group, where ATP accumulation is prevented, there is a twofold increase in AMPK phosphorylation compared with HS group, indicating a correlation between AMPK activity and ATP accumulation. Since SERCA regulates the content of Ca2+ ions in the myoplasm, the content of markers of calcium-dependent signalling pathways was determined. In HS group was an increase in CaMKII phosphorylation by 204% and IP3R content by 41% compared with C group (p<0.05). The administration of CDN prevents an increase in CaMKII phosphorylation and IP3R content. It has been previously shown that IP3R-dependent delayed Ca2+ signals are involved in the activation of specific transcriptional programs of the phenotype of slow and fast muscle fibers.

We assessed the expression levels in atrophic process of ubiquitin and E3 ubiquitin ligase. The mRNA expression of ubiquitin and E3 ubiquitin ligase MuRF1, MAFbx and Cbl-b was significantly increased in HS group compared with control by 158, 37, 136 and 101%, respectively. CDN administration at 3 days of suspension prevented an increase in MurF1 mRNA expression (but not MAFbx) and significantly lowered increase in Cbl-b and ubiquitin expression (p<0.05). The expression of E3 ubiquitin ligases can be regulated by a variety of transcription factors, such as MYOG, FoxO3. The level of FoxO3 phosphorylation was slightly reduced in all suspended groups (HS and CDN) relative to control. MYOG expression was increased in HS group by 14% relative to control (p<0.05). In CDN group, the level of MYOG mRNA did not differ from the control group. Thus, a decrease in the expression of MuRF1 E3 ligase upon the administration of SERCA activator is associated with a decrease in transcriptional activity of myogenin.

Analysis of anabolic signaling markers showed that level of p-p70S6K phosphorylation did not change after suspension for 3 days, while phosphorylation of 4E-BP and P90RSK was equally reduced in both suspended groups – HS and CDN. However, phosphorylation of ribosomal protein S6 (Ser240/244) and (Ser235/236) was reduced only in HS group by 83 and 55%, respectively, compared with control (p<0.05), and the administration of CDN prevented this decrease. The level of eEF2 phosphorylation increases by 148% in HS group compared to control, which reduces the rate of elongation processes in unloaded muscles. Administration of the SERCA activator completely prevented the increase in eEF2 phosphorylation. GSK-3b can regulate both anabolic and proteolytic processes, as it is an endogenous inhibitor of protein synthesis and a promoter of protein degradation. We found a 26% reduction in GSK-3b phosphorylation in HS group compared with control (p<0.05), which was completely prevented by CDN1163 administration.

Conclusion: with a 3-day m. soleus functional unloading, the administration of the SERCA activator did not affect markers of mTORC1-dependent signalling, but prevented a decrease in phosphorylation of anabolic markers – GSK3b, eEF2, and S6 ribosomal protein, which together could improve the efficiency of translation. The transcription factors FoxO3 and MYOG are activated during functional unloading of m. soleus, but MYOG may be involved in the regulation of E3 expression by MurF1 and Cbl-b ligases upon SERCA activation. The SERCA CDN1163 activator influences the regulation of Ca-dependent signalling pathways during muscle unloading through changes in CaMKII phosphorylation and IP3R levels.

This work was supported by the Russian Science Foundation No. 21-15-00228