Известно, что кардиомиоциты легочных вен могут проявлять спонтанную активность и быть источником эктопической и тригерной активности. В связи с этим изучение функции миокарда легочных вен играет важную роль в понимании развития фибрилляции предсердий. Кардиомиоциты легочных вен пронизывают толщу сосудов, и экстракардиальный миокард отличается по функциональным характеристикам от миокарда предсердий и желудочков [1]. В основном изучаются электрофизиологические особенности кардиомиоцитов легочных вен в сравнении с кардиомиоцитами левого предсердия [2]. Цель исследования заключалась в оптимизации методики выделения механически активных одиночных кардиомиоцитов легочных вен и анализе характеристик сокращения их саркомеров.

Манипуляции выполнены на морских свинках в соответствии с международными правилами обращения с лабораторными животными (Директива 2010/63/ЕU) и одобрены этическим комитетом ИИФ УрО РАН.

Одиночные кардиомиоциты получали методом ретроградной перфузии сердца по Лангендорфу с модификациями [3]. Перед выделением одиночных кардиомиоцитов животным вводилась внутримышечно инъекция гепарина натрия (5000 МЕ/кг) для предотвращения развития тромбоза коронарных артерий. После эвтаназии сердце в открытой грудной клетке промывалось охлаждённым (15-16ºC) раствором Solution A, затем помещалось на установку Лангендорфа, где подвергалось ретроградной перфузии (4.0–4.5 мл/мин) последовательной сменой трёх растворов при 35ºC. На первом этапе сердце в течение 5 минут промывалось содержащим гепарин натрия раствором Solution A для очищения коронарных сосудов от крови и стабилизации сердечных сокращений в in vitro условиях. Далее для снижения возбудимости и ингибирования сократительной функции сердце перфузировалось раствором с высоким содержанием K+ и низким содержанием Са2+ в течение 10 минут с момента полной остановки сокращений. Для успешной изоляции одиночных кардиомиоцитов из миокардиальных «рукавов» легочных вен был осуществлен подбор оптимального времени перфузии и концентраций ферментов. Межклеточный каркас ферментативно расщеплялся коллагеназой II (0.5 мг/мл, Worthington, США) и протеазой XIV (0.05 мг/мл, Sigma-Aldrich, США). При достижении признаков промежуточного расщепления межклеточного каркаса в виде прогрессирующей бледности эпикардиальной поверхности сердца и появления вязких капель, ретроградная перфузия прекращалось. Предсердия и миокард легочных вен подвергались дополнительным инъекциям раствором с высоким содержанием коллагеназы (0.5 мг/мл, 6–7 мл/мин) в течение 20 минут, после чего процедура получения клеток была аналогична описанной [3]. Готовая суспензия изолированных миоцитов хранилась в HEPES-содержащем буфере Тирод при 22–24 ºC и использовалась в течение 6-8 часов.

Измерения сократительной функции изолированных кардиомиоцитов были выполнены при 35-37ºC и частоте электрической стимуляции 1 Гц на специализированном оборудовании (IonOptix Corporation, USA). Показано, что амплитудные и временные характеристики сокращения саркомеров кардиомиоцитов легочных вен отличаются от характеристик сокращения кардиомиоцитов левого предсердия.

В результате работы оптимизирована методика выделения механически активных одиночных кардиомиоцитов из миокардиальных «рукавов» легочных вен сердца морских свинок и получены первые данные о характеристиках сокращения кардиомиоцитов экстракардиального миокарда.

Эксперименты выполнены на оборудовании ЦКП ИИФ УрО РАН при поддержке гранта РНФ № 23-24-00356.



1. Takahara A, Hagiwara M, Namekata I, Tanaka H. Pulmonary vein myocardium as a possible pharmacological target for the treatment of atrial fibrillation. J Pharmacol Sci. 2014;126(1):1-7.

2. Potekhina VM, Averina OA, Razumov AA, Kuzmin VS, Rozenshtraukh LV. The local repolarization heterogeneity in the murine pulmonary veins myocardium contributes to the spatial distribution of the adrenergically induced ectopic foci. J Physiol Sci. 2019;69(6):1041- 1055.

3. Butova, X. A., Myachina, T. A. and Khokhlova, A. D. A combined Langendorff-injection technique for simultaneous isolation of single cardiomyocytes from atria and ventricles of the rat heart // MethodsX. 2021.

It is known that cardiomyocytes of pulmonary veins can show spontaneous activity, be a source of ectopic and trigger activity. In this regard, the study of the function of the myocardium of the pulmonary veins plays an important role in understanding the development of atrial fibrillation. Cardiomyocytes of the pulmonary veins penetrate the thickness of the vessels, and the extracardial myocardium differs in functional characteristics from the myocardium of the atria and ventricles [1]. The electrophysiological features of cardiomyocytes of the pulmonary veins are mainly studied in comparison with cardiomyocytes of the left atrium [2]. The aim of the study was to optimize the method of isolation of mechanically active single cardiomyocytes of pulmonary veins and to analyze the characteristics of the contraction of their sarcomeres.

The manipulations were performed on guinea pigs in accordance with Directive 2010/63/EU and approved by the Ethics Committee of the IIP UB RAS.

Single cardiomyocytes were obtained by a standard technique of Langendorff perfusion with modifications [3]. Before isolation of single cardiomyocytes, animals were injected intramuscularly with sodium heparin (5000 IU/kg) to prevent the development of coronary artery thrombosis. After euthanasia, the heart in the open chest was washed with a cooled (15-16° C) solution A, then placed on a Langendorff, where it was subjected to retrograde perfusion (4.0–4.5 ml/min) by successive change of three solutions at 35° C. At the first stage, the heart was washed for 5 minutes with a Solution A containing heparin sodium to cleanse the coronary vessels of blood and stabilize heart contractions in vitro. Further, to reduce excitability and inhibit contractile function, the heart was perfused with a solution with a high K+ content and a low Ca2+ content for 10 minutes from the moment of complete cessation of contractions. To successfully isolate single cardiomyocytes from the myocardial "sleeves" of the pulmonary veins, the optimal perfusion time and enzyme concentrations were selected. The intercellular framework was enzymatically cleaved by collagenase II (0.5 mg/ml, Worthington, USA) and protease XIV (0.05 mg/ml, Sigma-Aldrich, USA). When signs of intermediate cleavage of the intercellular framework were reached in the form of progressive pallor of the epicardial surface of the heart and the appearance of viscous droplets, retrograde perfusion was stopped. The atria and myocardium of the pulmonary veins were subjected to additional injections with a solution with a high collagenase content (0.5 mg/ml, 6-7 ml/min) for 20 minutes, after which the procedure for obtaining cells was similar to that described [3]. The finished suspension of isolated myocytes was stored in a HEPES-containing buffer Tyrod at 22-24 ° C and used for 6-8 hours.

Measurements of the contractile function of isolated cardiomyocytes were performed at 35-37ºC and an electrical stimulation frequency of 1 Hz on specialized equipment (IonOptix Corporation, USA). It is shown that the amplitude and time characteristics of the contraction of sarcomeres of cardiomyocytes of the pulmonary veins differ from the characteristics of the contraction of cardiomyocytes of the left atrium.

As a result of the work, the method of isolation of mechanically active single cardiomyocytes from the myocardial "sleeves" of the pulmonary veins of the heart of guinea pigs was optimized and the first data on the characteristics of contraction of cardiomyocytes of the extracardial myocardium were obtained.

The experiments were carried out on the equipment of the Central Research Institute of the IIF of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences with the support of the RNF grant No. 23-24-00356.



1. Takahara A, Hagiwara M, Namekata I, Tanaka H. Pulmonary vein myocardium as a possible pharmacological target for the treatment of atrial fibrillation. J Pharmacol Sci. 2014;126(1):1-7.

2. Potekhina VM, Averina OA, Razumov AA, Kuzmin VS, Rozenshtraukh LV. The local repolarization heterogeneity in the murine pulmonary veins myocardium contributes to the spatial distribution of the adrenergically induced ectopic foci. J Physiol Sci. 2019;69(6):1041- 1055.

3. Butova, X. A., Myachina, T. A. and Khokhlova, A. D. A combined Langendorff-injection technique for simultaneous isolation of single cardiomyocytes from atria and ventricles of the rat heart // MethodsX. 2021.