Предыдущие исследования продемонстрировали, что на начальной стадии разгрузки задних конечностей (1-2 дня) наблюдается резкое снижение ЭМГ-активности камбаловидной мышцы крысы [1, 2]. Однако мышечная электрическая активность начинает увеличиваться после 48 часов разгрузки, а через 3 дня значительно отличается от значений, зарегистрированных сразу после начала воздействия [2]. Кроме того, было показано, что ЭМГ-активность камбаловидной мышцы крысы прогрессивно возрастает со 2-го по 6-й день функциональной разгрузки [2]. Мы предположили, что автономная активность является результатом значительного снижения экспрессии калий-хлоридного ко-транспортера KCC-2 в нейронах поясничного отдела спинного мозга с последующим изменением направления хлоридного тока и инверсией мембранного потенциала, приводящего к резкому повышению возбудимости мотонейронов [3], что наблюдалось в нашем предыдущем исследовании после 7-дневной функциональной разгрузки [2]. Действительно, ежедневное введение прохлорперазина, предотвращающего снижение KCC2, ослабляло автономную активность камбаловидной мышцы [2]. Целью настоящего исследования было изучение внутримышечных последствий снижения автономной активности мышцы при введении прохлорперазина в течение трех суток моделируемой гравитационной разгрузки. Животные были распределены на следующие группы: группа контроля – C; группа антиортостатического вывешивания 3 суток – 3HS, группа вывешивания 3 суток с ежедневным внутрибрюшинным введением прохлорперазина – 3HS+P.

В ходе 3-суточной экспозиции животных в условиях безопорности введение препарата прохлорперазин не предотвратило снижения изометрической силы, но способствовало сохранению собственной жесткости камбаловидной мышцы крысы. При анализе маркеров анаболических сигнальных путей было обнаружено поддержание уровня фосфорилирования фактора инициации трансляции 4E (4E-BP1) на уровне контроля при использовании прохлорперазина. Фосфорилирование рибосомального белка S6 (S6RP) было повышено на 85% в группе 3HS+P и, при этом, снижено на 58% в группе «чистого» вывешивания 3HS. Таким образом, введение прохлорперазина предотвратило снижение уровней фосфорилирования двух мишеней mTOR. Можно предположить, что на 1-3 сутки вывешивания блокирование спонтанной тонической мышечной активности привело к более выраженному снижению активности АМФ-активируемой протеинкиназы (АМПК). Поскольку АМПК находится в реципрокных отношениях с mTOR [4], ее подавление могло вызвать активацию mTOR. Другим возможным механизмом влияния блокирования спонтанной тонической мышечной активности на mTOR-зависимые сигнальные пути может быть предотвращение роста содержания активных форм кислорода (АФК). Известно, что при вывешивании в мышцах, начиная с самых ранних сроков воздействия, возрастает содержание АФК [5], что может приводить к инактивации сигнального пути mTOR/Akt, а также способствовать дефосфорилированию и активации регулятора протеолиза FOXO3 [6]. В настоящем эксперименте активность транскрипционного фактора FOXO3 была статистически значимо снижена в группе 3HS+P по сравнению с группой 3HS. Следует отметить, что ключевую роль в этих эффектах играет АФК-зависимая активация МАП-киназ p38 и JNK. Мы обнаружили, что после 7 суток вывешивания введение прохлорперазина сопровождалось достоверным уменьшением содержания супероксидных анионов (по флуоресценции дигидроэтидия) и пониженным уровнем фосфорилирования MAPкиназ p38 и JNK в мышце по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор на фоне разгрузки. Таким образом, предотвращение роста АФК при введении прохлорперазина может способствовать как блокированию роста показателей протеолиза, так и предотвращению инактивации сигнального пути mTOR.

Работа поддержана грантом Российского Научного Фонда № 22-15-00151.

1. Kawano F., Ishihara, A., Stevens, J.L., Wang, X.D., Ohshima, S., Horisaka, M., Maeda, Y., Nonaka, I., Ohira, Y. Tension- and afferent input-associated responses of neuromuscular system of rats to hindlimb unloading and/or tenotomy // American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 2004. V. 287. R76-86.

2. Kalashnikov V.E., Tyganov, S.A., Turtikova, O.V., Kalashnikova, E.P., Glazova, M.V., Mirzoev, T.M., Shenkman, B.S. Prochlorperazine withdraws the delayed onset tonic activity of unloaded rat soleus muscle: a pilot study // Life. 2021. Vol. 11. 1161.

3. Boulenguez P., Liabeuf, S., Bos, R., Bras H., Jean-Xavier C., Brocard C., Stil A., Darbon P., Cattaert D., Delpire E., et al. Down-regulation of the potassium-chloride cotransporter KCC2 contributes to spasticity after spinal cord injury // Nature medicine. 2010. V. 16. P. 302-307.

4. Vilchinskaya N.A., Krivoi II., Shenkman B.S. AMP-Activated Protein Kinase as a Key Trigger for the Disuse-Induced Skeletal Muscle Remodeling // International journal of molecular sciences. 2018. V.19. 3558.

5. Vitadello M., Germinario E., Ravara B., Libera L.D., Danieli-Betto D., Gorza L. Curcumin counteractsloss of force and atrophy of hindlimb unloaded rat soleus by hampering neuronal nitric oxide synthaseuntethering from sarcolemma // J. Physiol. 2014. V. 592. P. 2637–265.

6. McClung J.M., Judge A.R., Powers S.K., Yan Z. p38 MAPK links oxidative stress to autophagy-related gene expression in cachectic muscle wasting // Am J Physiol Cell Physiol. 2010. V. 298. P. 542-9.

Previous studies clearly demonstrated that there is a sharp decline in rat soleus EMG activity at the initial stage of hindlimb suspension (HS) (1-2 days) [1, 2]. However, soleus muscle electrical activity starts increasing after 48 h of exposure to HS, and after 3 days of HS the soleus muscle EMG activity significantly differs from the values recorded immediately after the onset of HS [2]. Furthermore, it has been shown that rat soleus muscle EMG activity progressively increases from day 2 to day 6 of HS [2]. We assumed that autonomous activity is the result of a significant decrease in the expression of the potassium chloride co-transporter KCC-2 in neurons of the lumbar spinal cord, followed by a change in the direction of the chloride current and inversion of the membrane potential, leading to a sharp increase in the excitability of motor neurons [3] that was observed in our previous study following 7-day HS [2]. Indeed, daily prochlorperazine administration, decreasing KCC2, attenuated the autonomous soleus muscle activity [2]. The aim of this study was to examine the signaling events during prochlorperazine administration that significantly reduces the tonic autonomous electrical activity of rat soleus muscle under conditions of 3-day simulated gravitational unloading. The animals were divided into the following groups: control group – C; hindlimb suspension group for 3 days – 3HS, hindlimb suspension for 3 days with daily intraperitoneal administration of prochlorperazine – 3HS+P.

During the 3-day HS the administration of the prochlorperazine did not prevent a decrease in isometric strength, but contributed to the preservation of intrinsic stiffness of the soleus muscle. When analyzing markers of anabolic signaling pathways after 3 days of exposure, it was found that the level of phosphorylation of the translation initiation factor 4E (4E-BP1) was maintained at the control level when using prochlorperazine. Phosphorylation of ribosomal protein S6 (S6RP) was increased by 85% in 3HS+P group and, at the same time, decreased by 58% in 3HS group. Thus, the administration of prochlorperazine prevented a decrease in the phosphorylation levels of two mTOR targets. It can be assumed that on the 1-3 day ofunloading, blocking spontaneous tonic muscle activity led to a more pronounced decrease in the activity of AMP-activated protein kinase (AMPK). Since AMPK is in reciprocal relations with mTOR [4], its suppression could cause activation of mTOR. Another possible mechanism for the effect of blocking spontaneous tonic muscle activity due to the introduction of prochlorperazine on mTOR-dependent signaling pathways may be the prevention of an increase in the content of reactive oxygen species (ROS). It is known that starting from the earliest periods of functional unloading the number of ROS increases [5] and can lead to inactivation of the mTOR/Akt signaling pathway, as well as contribute to dephosphorylation and activation of the proteolytic regulator FOXO3 [6]. In the present study, the activity of the transcription factor FOXO3 was significantly reduced in 3HS+P group compared to 3HS group. It should be noted that the ROS-dependent activation of MAP kinases p38 and JNK plays a key role in these effects. We found that after 7 days of HS, the administration of prochlorperazine was accompanied by a significant decrease in the content of superoxide anions (according to dihydroethidium fluorescence) and a reduced level of phosphorylation of MAPkinases p38 and JNK in the muscle compared to animals receiving saline solution. Thus, preventing the accumulation of ROS with prochlorperazine administration can contribute to both inhibiting the proteolysis and preventing the inactivation of the mTOR signaling pathway.

The work was supported by the grant of the Russian Science Foundation No. 22-15-00151.

1. Kawano F., Ishihara, A., Stevens, J.L., Wang, X.D., Ohshima, S., Horisaka, M., Maeda, Y., Nonaka, I., Ohira, Y. Tension- and afferent input-associated responses of neuromuscular system of rats to hindlimb unloading and/or tenotomy // American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 2004. V. 287. R76-86.

2. Kalashnikov V.E., Tyganov, S.A., Turtikova, O.V., Kalashnikova, E.P., Glazova, M.V., Mirzoev, T.M., Shenkman, B.S. Prochlorperazine withdraws the delayed onset tonic activity of unloaded rat soleus muscle: a pilot study // Life. 2021. Vol. 11. 1161.

3. Boulenguez P., Liabeuf, S., Bos, R., Bras H., Jean-Xavier C., Brocard C., Stil A., Darbon P., Cattaert D., Delpire E., et al. Down-regulation of the potassium-chloride cotransporter KCC2 contributes to spasticity after spinal cord injury // Nature medicine. 2010. V. 16. P. 302-307.

4. Vilchinskaya N.A., Krivoi II., Shenkman B.S. AMP-Activated Protein Kinase as a Key Trigger for the Disuse-Induced Skeletal Muscle Remodeling // International journal of molecular sciences. 2018. V.19. 3558.

5. Vitadello M., Germinario E., Ravara B., Libera L.D., Danieli-Betto D., Gorza L. Curcumin counteractsloss of force and atrophy of hindlimb unloaded rat soleus by hampering neuronal nitric oxide synthaseuntethering from sarcolemma // J. Physiol. 2014. V. 592. P. 2637–265.

6. McClung J.M., Judge A.R., Powers S.K., Yan Z. p38 MAPK links oxidative stress to autophagy-related gene expression in cachectic muscle wasting // Am J Physiol Cell Physiol. 2010. V. 298. P. 542-9.