Различные экологические и патофизиологические стимулы могут вызывать значительную атрофию скелетных мышц у млекопитающих и человека. Восстановление атрофированных мышечных волокон зависит от стволовых (сателлитных) клеток (СК), которые располагаются за пределами сарколеммы. Было показано, что мышечная атрофия, вызванная гипокинезией, приводит к дефициту СК у грызунов и ухудшению процесса регенерации мышечной ткани. Также известно, что мышечная атрофия, вызванная денервацией, может повышать восприимчивость СК к апоптозу. Поскольку мы недавно обнаружили снижение активности АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) во время «аномально ускоренной» дифференцировки первичных миобластов, полученных из атрофированной камбаловидной мышцы крысы, мы предположили, что может существовать потенциальная связь между активностью AMPK и восприимчивостью дифференцирующихся миобластов к апоптозу. Следовательно, цель исследования состояла в оценке влияния активации AMPK на экспрессию маркеров апоптоза в дифференцирующихся миобластах, полученных из атрофированной камбаловидной мышцы крысы.

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН. Тридцать самцов крыс линии Wistar массой 190-210 г были случайным образом распределены на следующие 2 группы: контрольную (C, n=10) и группу животных, которые подверглись 7-суточному вывешиванию задних конечностей (модель атрофии мышц задних конечностей) (HS, n=20). Камбаловидные мышцы контрольных и вывешенных крыс и крыс после HS были хирургически выделены из обеих задних конечностей с использованием стандарт методов препарирования и использованы для выделения пула СК. Эвтаназия животных осуществлялась методом декапитации под изофлурановым наркозом. Миобласты, полученные из камбаловидных мышц вывешенных крыс (HS), были разделены на две части: клетки, которые инкубировались с AICAR (активатор AMPK), и клетки, которые не подвергались действию AICAR. Первичные миобласты, выделенные из камбаловидных мышц контрольных крыс, не обрабатывались AICAR. Уровень фосфорилирования AMPK и ацетил-КоА-карбоксилазы (ACC) оценивали методом Вестерн-блоттинга. Экспрессию мРНК маркеров апоптоза оценивали методом ОТ-ПЦР.

В дифференцирующихся миобластах, полученных из атрофированной камбаловидной мышцы, наблюдалось значительное снижение (р <0,05) фосфорилирования AMPK (Thr172) и ACC (Ser79) по сравнению с контрольными клетками. Это снижение активности AMPK сопровождалось значительным повышением уровня проапоптотических маркеров (каспазы-9, BAX, р53) и понижением уровня экспрессии антиапоптотического белка BCL-2. Инкубация «атрофических» мышечных миобластов с AICAR во время дифференцировки предотвращала снижение фосфорилирования AMPK и ACC. Более того, инкубация с AICAR предотвратило увеличение экспрессии каспазы-9, BAX, p53 и снижение экспрессии мРНК BCL-2.

Таким образом, поддержание активности AMPK с помощью AICAR подавляет повышенную экспрессию мРНК маркеров апоптоза в дифференцирующихся миобластах, полученных из атрофированной камбаловидной мышцы крысы. Исследование поддержано грантом РНФ № 20-75-10080.

Various environmental and pathophysiological stimuli can induce a significant loss of skeletal muscle tissue. Regrowth of atrophied myofibers depends on muscle satellite stem cells (SCs) that exist outside the myofiber plasma membrane. It was shown that disuse-induced atrophy appears to result in deficits in the SCs of rodents, manifested by an inability of muscle tissue to grow or to regenerate. It is also known that denervation-induced muscle atrophy can increase susceptibility of SCs to apoptosis. Since we recently found a decrease in AMP-activated protein kinase (AMPK) activity during enhanced differentiation of primary myoblasts derived from atrophic rat soleus muscle, we hypothesized that there may be a potential link between AMPK activity and susceptibility of differentiating myoblasts to apoptosis. Hence, the aim of the study was to estimate the effect of AMPK activation on the expression of apoptotic markers in differentiating myoblasts derived from atrophied rat soleus muscle.

All experimental procedures were approved by the Biomedicine Ethics Committee of the Institute of Biomedical Problems of the RAS. Thirty male Wistar rats weighing 190-210 g were randomly assigned to the following 2 groups: control (C, n=10) and 7-day hindlimb suspension (HS, n=20). Under anesthesia, soleus muscles from control and HS rats were surgically excised from both hindlimbs using standardized dissection methods and then used for isolation of the pool of muscle SCs. After muscle excision, the rats were sacrificed by decapitation under isoflurane anesthesia. Myoblasts derived from the soleus muscles of HS rats were divided into two parts: AICAR-treated cells and non-treated cells. Primary myoblasts isolated from the soleus muscles of the control rats were not treated with AICAR. AMPK and acetyl-CoA carboxylase (ACC) phosphorylation levels were assessed by Western-blotting. mRNA expression of the apoptotic markers was evaluated by RT-PCR.

In differentiating myoblasts derived from the atrophied soleus muscle there was a significant decrease (p<0.05) in AMPK (Thr172) and ACC (Ser79) phosphorylation compared to the control cells. This reduction in AMPK activity was accompanied by a significant upregulation of pro-apoptotic markers Caspase-9, BAX, p53 and downregulation of anti-apoptotic BCL-2. Treatment of atrophic muscle-derived myoblasts with AICAR during differentiation prevented a reduction in AMPK and ACC phosphorylation. Moreover, AICAR treatment attenuated an increase in the expression of Caspase-9, BAX, p53 and prevented a decrease in BCL-2 mRNA expression.

Thus, the maintenance of AMPK activity with AICAR treatment suppresses the enhanced mRNA expression of apoptotic markers in differentiating myoblasts derived from atrophied rat soleus muscle. The study was supported by the RSF grant # 20-75-10080.