VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Биомеханика. Биологическая подвижность

Роль белков теплового шока HSP90α и HSP90β в миграции клеток фибросаркомы человека HT1080

В.С. Петренко1*, В.В. Врублевская1, М.А. Жмурина1, Ю.Ю. Скарга1, О.С. Моренков1

1.Институт биофизики клетки Российской академии наук – обособленное подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН, Пущино, Россия;

* 79182797935(at)yandex.ru

Миграция клеток является сложным, тонко регулируемым биофизическим процессом, участвующим в различных этапах как нормального, так и патологического функционирования эукариотических организмов. Миграция клеток обеспечивает поддержание тканевого гомеостаза и морфогенеза, участвует в развитии иммунного ответа, процессе заживлении ран, а также в инвазии и метастазировании раковых клеток. Изучение клеточной миграции важно для понимания механизмов метастазирования злокачественных опухолевых клеток и разработки противоопухолевых препаратов антиметастатического действия.

Миграция клеток осуществляется за счёт реорганизации цитоскелета, в которую вовлечены актин и миозин II. Полимеризация актиновых филаментов на периферии клетки приводит к росту ламеллоподий, актин участвует в формировании стрессовых фибрилл, обеспечивающих скольжение актиновых филаментов относительно друг друга за счёт действия моторных белков, в основном миозина II. Возникающее в результате полимеризации актина и сокращения стрессовых волокон механическое напряжение в конечном итоге передается на экстраклеточный субстрат через сайты адгезии, тем самым обеспечивая движение клеток. Регуляция процесса миграции клеток осуществляется системой внутриклеточной сигнализации, в которой принимают участие рецепторы, белки, модифицирующие цитоскелет, киназы, различные адаптерные и сигнальные белки и т.д. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является высококонсервативным белком-шапероном, обеспечивающим фолдинг, стабилизацию и деградацию множества внутриклеточных белков (более 700 белков-клиентов), в том числе белков, связанных с клеточной подвижностью. Hsp90 играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза, в выживании и дифференцировки клеток, пролиферации, канцерогенезе, клеточной миграции и других клеточных процессах. Известны две изоформы Hsp90, стресс-индуцируемая изоформа Hsp90α, кодируемая у человека геном HSP90ΑA1, и конститутивно экспрессируемая изоформа Hsp90β, кодируемая у человека геном HSP90ΑB1. Изоформы Hsp90 имеют высокую гомологию по аминокислотной последовательности (~86%), в связи с чем Hsp90α- и Hsp90β изоформы демонстрируют как сходство, так и различия в функционировании в клетке. К настоящему времени специфическая функциональная роль Hsp90α и Hsp90β в миграции клеток не определена. Целью нашего исследования являлось определение роли отдельных изоформ Hsp90 в процессах, связанных с клеточной подвижностью.

Для исследования роли одной изоформы Hsp90 в клеточных процессах необходимо подавление активности другой изоформы. К настоящему времени не описаны специфические ингибиторы Hsp90α и Hsp90β. Мы пошли по пути создания клеточных линий, нокаутированных по генам, кодирующим разные изоформы Hsp90. На основе никазного Crispr/Cas9 вектора AIO-GFP были созданы две конструкции для мутагенеза 1 экзона генов HSP90AA1 и HSP90ΑB1 в клетках фибросаркомы человека НТ1080. Правильность созданных плазмид была подтверждена с помощью секвенирования. Проведена трансфекция клеток с помощью электропорации и получены 3 мутантные линии НТ1080, не экспрессирующие Hsp90α, и 3 мутантные линии, не экспрессирующие Hsp90β, что было доказано методами иммуноблоттинга и проточной цитометрии c использованием Hsp90α- и Hsp90β-специфических антител. Секвенирование клонотек всех моноклонов выявило в 1 экзоне генов HSP90AA1 и HSP90ΑB1 наличие делеций и инсерций в обеих аллелях мутантных клонов, приводящих к сдвигу рамки считывания Hsp90α и Hsp90β. В результате, были получены мутантные линии НТ1080 с биаллельным нокаутом гена HSP90ΑA1, кодирующего Hsp90α, и биаллельным нокаутом гена HSP90ΑВ1, кодирующего Hsp90β.

Далее мы исследовали как отсутствие Hsp90α и Hsp90β в клетках НТ1080 влияет на их способность к миграции. Оценку клеточной миграции проводили с помощью метода «заживления раны», нанесенной на монослой клеток. Для создания «раны» использовали силиконовые 2-луночные культуральные вставки (Ibidi, США), обеспечивающие формирование зазора (~500 мкм) на конфлуентном монослое клеток. После формирования «раны» на клеточном монослое через определенные интервалы времени делали фотографирование «раны» и оценивали скорость ее зарастания клетками. При проведении экспериментов использовали клетки, находящиеся в разном физиологическом состоянии (культивирование клеток до начала эксперимента в присутствии или в отсутствии сыворотки), использовали разные условия в процессе миграции (разные концентрации сыворотки, бессывороточная среда). Показано, что скорость миграции исходных клеток HT1080 и всех клеточных моноклонов с нокаутом Hsp90α или Hsp90β была сопоставима независимо от условий проведения экспериментов. Стоит отметить, что все клоны сохранили способность к активной пролиферации, которая не отличалась от пролиферации клеток НТ1080.

Таким образом, на мутантных линиях с нокаутированными генами HSP90AA1 или HSP90ΑB1 показано, что отсутствие Hsp90α или Hsp90β изоформы практически не влияло на миграцию клеток. Полученные результаты могут свидетельствовать об отсутствии строго Hsp90α- или Hsp90β-специфических клиентских белков среди белков, участвующих в процессе миграции клеток. С другой стороны, в полученных моноклонах отсутствовала только одна из изоформ Hsp90. Возможно, одна изоформа компенсирует отсутствие другой изоформы Hsp90, принимая на себя её функции или часть функций. Полученные нами результаты ставят под сомнение общепринятое мнение о критической роли экстраклеточного Hsp90α в клеточной локомоции. Все клеточные линии НТ1080, не экспрессирующие внутриклеточного и, как следствие, внеклеточного Hsp90α, продолжали мигрировать in vitro со скоростью, сопоставимой скорости миграции исходной культуры НТ1080. Необходимы дополнительные исследования для детального изучения роли и взаимозаменяемости Hsp90α и Hsp90β в различных клеточных процессах, в том числе и в обеспечении клеточной миграции.

The role of heat shock proteins HSP90α and HSP90β in the migration of HT1080 human fibrosarcoma cells

V.S. Petrenko1*, V.V. Vrublevskaya1, M.A. Zhmurina1, Y.Y. Skarga1, O.S. Morenkov1

1.Institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”, Pushchino, Russia;

* 79182797935(at)yandex.ru

Cell migration is a complex, finely regulated biophysical process involved in various stages of both normal and pathological functioning of eukaryotic organisms. Cell migration ensures the maintenance of tissue homeostasis and morphogenesis, participates in the development of the immune response, the process of wound healing, as well as in the invasion and metastasis of cancer cells. Studying cell migration is important for understanding the mechanisms of metastasis of malignant tumor cells and the development of antimetastatic anticancer drugs.

Cell migration is realized via reorganization of the cytoskeleton, in which actin and myosin II are involved. Polymerization of actin filaments at the cell periphery leads to the growth of lamellipodia. Actin is also involved in the formation of stress fibrils, which ensure the sliding of actin filaments relative to each other due to the action of motor proteins, mainly myosin II. The mechanical tension that results from actin polymerization and contraction of stress fibers is ultimately transferred to the extracellular substrate through adhesion sites, thereby providing cell movement. The process of cell migration is regulated by the intracellular signaling system involving receptors, cytoskeleton-modifying proteins, kinases, various adapter and signaling proteins, etc. Heat shock protein 90 (Hsp90) is a highly conserved chaperone protein that mediates folding, stabilization, and degradation of many intracellular proteins (more than 700 client proteins), including proteins associated with cell motility. Hsp90 plays an important role in cellular homeostasis maintenance, cell survival and differentiation, proliferation, carcinogenesis, cell migration, and other cellular processes. Two isoforms of Hsp90 are known: stress-induced Hsp90α and constitutively expressed Hsp90β, encoded in humans by the HSP90ΑA1 HSP90ΑB1 genes, respectively. The Hsp90 isoforms have a high amino acid sequence homology (~86%), and therefore the Hsp90α and Hsp90β isoforms demonstrate both similar and differing functional properties in the cell. To date, the specific functional role of Hsp90α and Hsp90β in cell migration has not been elucidated. The aim of our study was to determine the role of individual Hsp90 isoforms in the processes associated with cell motility.

To study the role of one Hsp90 isoform in cellular processes, it is necessary to suppress the activity of the other isoform. To date, specific inhibitors of Hsp90α and Hsp90β have not been described. We have chosen an approach to generate cell lines with knocked-out genes encoding different isoforms of Hsp90. Based on the CRISPR/Cas9 nickase vector AIO-GFP, two constructs were created for mutagenesis of exon 1 of the HSP90AA1 and HSP90ΑB1 genes in HT1080 human fibrosarcoma cells. The correctness of the generated plasmids was confirmed by sequencing. The cells were transfected by electroporation and 3 HT1080 Hsp90α-null mutant lines and 3 Hsp90β-null mutant lines were obtained, as confirmed by immunoblotting and flow cytometry using Hsp90α- and Hsp90β-specific antibodies. Sequencing of the clone libraries generated for all monoclones revealed the presence of deletions and insertions in exon 1 of genes HSP90AA1 and HSP90ΑB1 in both alleles of the mutant clones, which provide shifts of the open reading frames of Hsp90α and Hsp90β. As a result, HT1080 mutant lines with a biallelic knockout of the HSP90ΑA1 gene encoding Hsp90α and a biallelic knockout of the HSP90ΑB1 gene encoding Hsp90β were obtained.

Next, we investigated how the absence of Hsp90α and Hsp90β in HT1080 cells affects their migration ability. Cell migration assessment was performed using the method of healing of a “wound” created on a cell monolayer. The “wound”, was created using silicone 2-well culture inserts (Ibidi, USA), which ensured the formation of a gap (~500 μm) on a confluent monolayer of cells. Following “wound” formation on the cell monolayer, the “wound” was photographed at certain time intervals, and the rate of “wound” overgrowth by cells was estimated. In the experiments, cells in different physiological states (cell cultivation before the start of the experiment in the presence or absence of serum) were used, as well as various conditions during migration (different serum concentrations, serum-free medium). It was shown that the migration rate of the original HT1080 cells and all cell monoclones with Hsp90α or Hsp90β knockout was comparable regardless of the experimental conditions. It should be noted that all clones retained an ability for active proliferation, which did not differ from that of HT1080 cells.

Thus, on mutant lines with HSP90AA1 or HSP90ΑB1 knockouts, the absence of the Hsp90α or Hsp90β isoform was shown to exert nearly no effect on cell migration. The results obtained may indicate the absence of client proteins strictly specific to Hsp90α or Hsp90β among the proteins involved in the process of cell migration. On the other hand, only one of the Hsp90 isoforms was absent in the obtained monoclones. It is possible that one isoform compensates for the absence of another Hsp90 isoform and fully or partly fulfils its functions. Our results also call into question the generally accepted view concerning the critical role of extracellular Hsp90α in cellular locomotion. All HT1080 cell lines that do not express intracellular and, as a result, extracellular Hsp90α migrated in vitro at a rate comparable to that of the original HT1080 culture. Additional studies are needed to elucidate in more detail the role and interchangeability of Hsp90α and Hsp90β in various cellular processes, including cell migration.


Докладчик: Петренко В.П.
43
2023-02-10

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists