Миграция клеток является сложным биофизическим процессом, представляющим собой направленное движение одной или группы клеток в ответ на ряд биохимических (цитокины, хемокины, ростовые факторы) и биофизических сигналов, как внеклеточных, так и внутриклеточных. Клеточная миграция, основанная на функционировании актино-миозинового комплекса, играет критическую роль во многих физиологических и патологических процессах: в эмбриональном развитии организмов, при ранозаживлении, метастазировании опухолевых клеток, ремоделировании тканей. Известно, что белок теплового шока 90 (Hsp90), кроме выполнения важных внутриклеточных функций, связанных с его шаперонной активностью, активно секретируется во внешнюю среду и экспрессируется на поверхности клеток. Экстраклеточный Hsp90 функционирует в качестве мотогена, стимулирует процессы миграции и инвазии клеток in vitro, участвует в процессах ранозаживления и метастазирования опухолевых клеток in vivo. Существует две изоформы Hsp90, индуцибельная изоформа Hsp90α и конститутивная изоформа Hsp90β. Hsp90α считается более эффективным стимулятором клеточной миграции и инвазии, чем Hsp90β. Механизм действия экстраклеточного Hsp90 основывается на рецептор-зависимой активации сигнальных путей, обеспечивающих клеточную подвижность. Основными рецепторами Hsp90 являются LRP1 и HER2. Показано, что помимо белковых рецепторов важную роль в связывании Hsp90 на плазматической мембране играют поверхностные клеточные гепарансульфат протеогликаны (ГСПГ). Роль взаимодействия ГСПГ с мембрана-ассоциированным Hsp90 в процессах миграции/инвазии клеток в настоящее время не ясна, однако десульфирование и деградация ГСПГ приводит к значительной потере мембрана-ассоциированного Hsp90 с плазматической клеточной мембраны, что коррелирует со сниженной клеточной подвижностью. Однако, экспрессия Hsp90 на клеточной мембране в разных типах клеток и в разных физиологических условиях исследована недостаточно.

Целью работы было исследование мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 в клетках фибросаркомы человека НТ1080, находящихся в разных физиологических условиях. Для изучения мембранной экспрессии Hsp90 был использован метод иммунофлуоресценции с последующей регистрацией с помощью проточной цитофлуориметрии. В клетках фибросаркомы человека НТ1080 мембрана-ассоциированные Hsp90 окрашивали с использованием Hsp90α- и Hsp90β-специфических антител, вторичных анти-видовых Alexa488-меченных антител с последующей детекцией результатов с помощью проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter). Для дифференциации Hsp90, связанных с белковыми рецепторами или с ГСПГ, клетки обрабатывали гепарином – конкурентным ингибитором связывания Hsp90 с ГСПГ.

Несмотря на невысокий уровень Hsp90 на плазматической мембране клеток НТ1080 (количество мембрана-ассоциированного Hsp90 в 500 – 1000 раз меньше, чем внутриклеточного Hsp90) Hsp90 играет важную роль в миграции клеток, так как обработка клеток Hsp90-специфическими поликлональными кроличьими антителами приводила к снижению миграции и инвазии клеток НТ1080 in vitro. Мембрана-ассоциированные Hsp90α и Hsp90β существенно различались по аффинности взаимодействия с ГСПГ: Hsp90β были существенно более чувствительны к гепарину в сравнении с Hsp90α. Диссоциация Hsp90β от ГСПГ наблюдалась уже при концентрации гепарина 20 мкг/мл, в то время как диссоциация Hsp90α начиналась только при 50 мкг/мл. В клетках, находящихся на экспоненциальной и стационарной фазах роста, доля Hsp90α, ассоциированного с ГСПГ, составляла 30-50%, в то время, как доля ГСПГ-ассоциированного Hsp90β составляла 60-80%. При переходе от экспоненциальной к стационарной фазе роста клеток наблюдалось снижение уровня Hsp90α и Hsp90β на клеточной поверхности на 30-40%. При этом снижение экспрессии Hsp90α и Hsp90β на мембране было связано с уменьшением количества ГСПГ-ассоциированных Hsp90, в то время как уровень Hsp90, связанных с белковыми рецепторами, практически не зависел от фазы клеточного роста.

Показано, что культивирование клеток НТ1080 в отсутствии сыворотки в течении 24 ч приводит к незначительному снижению мембранной экспрессии Hsp90α (примерно на 10%), при этом около 75% Hsp90α оказывалось связанным с белковыми рецепторами, в то время как в клетках, культивируемых в среде с сывороткой, доля рецептор-связанного Hsp90α составляла 60-70%. В отличие от Hsp90α, содержание Hsp90β на плазматической мембране клеток после «сывороточного голодания» резко снижалось (примерно на 70%) в основном за счет потери Hsp90β, ассоциированного с ГСПГ, в то время как уровень рецептор-ассоциированного Hsp90β оставался неизменным в клетках, культивируемых в бессывороточной среде и среде с сывороткой.

Смена среды у клеток или простое перемешивание среды без ее смены уже через 2 ч приводило к повышению на 40-50% уровня мембрана-ассоциированных Hsp90α и Hsp90β в сравнении с клетками, находящимися в неподвижных культуральных флаконах. Мы полагаем, что данные манипуляции приводят к изменению клеточного микроокружения, что существенно влияло на экспрессию Hsp90α и Hsp90β на поверхности клеток.

Таким образом, мы обнаружили, что мембранная экспрессия двух изоформ Hsp90, которые играют важную роль в сложном биофизическом процессе - клеточной миграции, существенно зависит от условий культивирования клеток. При этом наибольшие изменения в мембранной экспрессии отмечались у Hsp90β, в то время как Hsp90α была менее подвержена изменениям. В менее благоприятных физиологических условиях (стационарная фаза роста клеток, отсутствие сыворотки) снижается уровень именно ГСПГ-ассоциированных Hsp90α и Hsp90β. На данный момент связь пролиферации и миграции клеток с уровнем мембрана-ассоциированных Hsp90α и Hsp90β не определена. Также необходимы дальнейшие исследования для прояснения механизма транслокации Hsp90 на мембрану и роли ГСПГ в этом процессе.

Cell migration is a complex biophysical process, which is the directional movement of one or a group of cells in response to a number of biochemical (cytokines, chemokines, growth factors) and biophysical signals, both extracellular and intracellular. Cellular migration, based on the functioning of the actin-myosin complex, plays a critical role in many physiological and pathological processes: in the embryonic development of organisms, in wound healing, metastasis of tumor cells, tissue remodeling. Heat shock protein 90 (Hsp90), performing important intracellular functions associated with its chaperone activity, is known to be actively secreted into the external environment and expressed on the cell surface. Extracellular Hsp90 functions as a motogen, stimulates the processes of cell migration and invasion in vitro, participates in the processes of wound healing and metastasis of tumor cells in vivo. There are two isoforms of Hsp90: the inducible isoform Hsp90α and the constitutive isoform Hsp90β. Hsp90α is considered to be a more effective stimulator of cell migration and invasion than Hsp90β. The mechanism of action of extracellular Hsp90 is based on receptor-dependent activation of signaling pathways that provide cell motility. The main Hsp90 receptors are LRP1 and HER2. It has been shown that in addition to protein receptors, surface cellular heparan sulfate proteoglycans (HSPG) play an important role in the binding of Hsp90 on the plasma membrane. The role of HSPG interaction with membrane-associated Hsp90 in the processes of cell migration/invasion is currently unclear; however, desulfation and degradation of HSPG leads to a significant loss of membrane-associated Hsp90 from the plasma cell membrane, which correlates with reduced cell motility. Yet, the expression of Hsp90 on the cell membrane in different cell types and under different physiological conditions has not been sufficiently studied.

The purpose of the study was an analysis of the membrane expression of two Hsp90 isoforms in human fibrosarcoma HT1080 cells under different physiological conditions. Immunofluorescence combined with registration using flow cytofluorimetry was used to study the membrane expression of Hsp90. Membrane-associated Hsp90s of HT1080 cells were stained using Hsp90α- and Hsp90β-specific antibodies, secondary anti-species Alexa488-labeled antibodies, with subsequent detection of the results using a CytoFLEX flow cytometer (Beckman Coulter). Cells were treated with heparin, a competitive inhibitor of Hsp90 binding to HSPG, to discriminate Hsp90s associated with protein receptors from those bound with HSPG.

Hsp90 plays an important role in cell migration, despite the low level of Hsp90 on the plasma membrane of HT1080 cells (the amount of membrane-associated Hsp90 is 500 – 1000 times lower compared to intracellular Hsp90), since the treatment of cells with Hsp90-specific polyclonal rabbit antibodies resulted in a decrease in migration and invasion of HT1080 cells in vitro. Membrane-associated Hsp90α and Hsp90β differed significantly in the affinity of interaction with HSPG: Hsp90β was significantly more sensitive to heparin compared to Hsp90α. Dissociation of Hsp90β from HSPG was observed already at 20 µg/ml heparin, while dissociation of Hsp90α started only at 50 µg/ml. In cells at exponential and stationary growth phases, the portion of Hsp90a associated with HSPG was 30-50%, while the portion of HSPG-associated Hsp90β was 60-80%. During the transition from the exponential to the stationary phase of cell growth, a 30-40% decrease in the level of Hsp90α and Hsp90β on the cell surface was observed. At the same time, the reduced expression of Hsp90α and Hsp90β on the membrane was due to a decrease in the number of HSPG-bound Hsp90, while the level of Hsp90 associated with protein receptors was virtually independent from the phase of cell growth.

It was shown that 24 h cultivation of HT1080 cells in the absence of serum leads to a slight decrease in the membrane expression of Hsp90α (by about 10%), while about 75% of Hsp90α was associated with protein receptors. Cells cultured in a medium with serum, had 60-70% receptor-bound Hsp90α. In contrast to Hsp90α, the level of Hsp90β on the plasma membrane of cells after "serum starvation" decreased sharply (by about 70%) mainly due to the loss of HSPG-associated Hsp90β, while the level of receptor-bound Hsp90β remained virtually the same in cells cultured in serum-free medium and medium with serum.

Following 2 h after culture medium replacement or simple medium stirring without replacement led to a 40-50% increase in the level of membrane-associated Hsp90α and Hsp90β compared with cells in still culture flasks. We believe that these manipulations mediated changes in the cellular microenvironment, which significantly affected the expression of Hsp90α and Hsp90β on the cell surface.

Thus, we found that the membrane expression of two isoforms of Hsp90, which play an important role in a complex biophysical process of cell migration, significantly depends on the conditions of cell culture. At the same time, the greatest changes in the membrane expression were observed in Hsp90β, while Hsp90α was less susceptible to changes. In less favorable physiological conditions (stationary phase growth of cells, absence of serum), the level of HSPG-associated Hsp90α and Hsp90β decreased. At present, the dependence of cell proliferation and migration from the levels of membrane-associated Hsp90α and Hsp90β is unclear. Further research is also needed to clarify the mechanism of Hsp90 translocation to the membrane and the role of HSPG in this process.