Введение

Сокращение сердца осуществляется благодаря взаимодействию миозина толстых нитей саркомера с актином тонких нитей и регулируется кальцием. В отсутствие кальция тропомиозин (Tpm) закрывает сайты связывания миозина на актине («блокирующее» состояние), при связывании кальция тропонином С тропомиозин перемещается по актину, открывая часть сайтов («закрытое» состояние), присоединение миозина к актину дальше активирует тонкую нить («открытое» состояние) [McKillop, Geeves, Biophys J., 1993]. В кальциевой регуляции сокращения принимает участие сердечный миозин-связывающий белок-C (сMyBP-C), сдвигая Tpm из «блокирующего» состояния в «закрытое» [Mun et al., PNAS, 2014; Wang et al., Compr Physiol., 2018]. В N-концевой части молекулы cMyBP-C содержатся сайты фосфорилирования (Ser275, Ser284 и Ser304). Фосфорилирование cMyBP-C ускоряет сокращение, увеличивая вероятность связывания миозина с актином и скорость развития силы [Sadayappan, de Tombe, Biophys Rev, 2012; Lynch et al. J Mol Cell Cardiol., 2021]. Мы исследовали влияние фосфорилирования cMyBP-C на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия в миокарде, используя in vitro подвижную систему (ИПС).

Методы исследования

Актин экстрагировали из скелетных мышц кролика. Миозин получали из левого желудочка сердца свиньи. Сердечный альфа-Tpm человека экспрессировали в E.coli. Тропониновый (Tn) комплекс человека был предоставлен И.А. Катруха (МГУ им А.В. Ломоносова). Регулируемые тонкие нити реконструировали из F-актина, Тn и Tpm. N-терминальные фрагменты человеческого cMyBP-C (С0-С2 фрагменты) с аминокислотными заменами S275D, S284D и S304D, имитирующими фосфорилирование, экспрессировали в E.coli.

Влияние фосфорилирования cMyBP-C на актин-миозиновое взаимодействие изучали в ИПС, которая позволяет регистрировать движение флуоресцентно-окрашенных нитей актина или тонких нитей по поверхности миозина в проточной ячейке [Kopylova et al., BBRC, 2017]. Скорость движения нитей анализировали программой GMimPro [Mashanov&Molloy, Biophys. J., 2007; Matyushenko et al., Biochemistry, 2017]. Кальциевую зависимость скорости нитей аппроксимировали уравнением Хилла и определяли следующие параметры: максимальную скорость нитей при насыщающей концентрации кальция, кальциевая чувствительность (рСа50) – значение рСа, при котором скорость полумаксимальная, и коэффициент кооперативности Хилла. Эксперименты проводились трижды. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Сравнения проводились по U-критерию Манна–Уитни (p <0,05).

Для исследования влияния фрагментов cMyBP-C на мостик-мостиковую (Xb-Xb) кооперативность проанализировали зависимость скорости тонких нитей от концентрации миозина и определили его концентрацию (с50), при которой скорость нитей является полумаксимальной.

Результаты

Для исследования влияния фосфорилирования cMyBP-C на актин-миозиновое взаимодействие мы проанализировали зависимость скорости скольжения F-актина по миозину в ИПС от концентрации C0-C2 фрагментов. Добавление С0-С2 фрагментов дозо-зависимо снижало скорость скольжения F-актина. Мы определили значение концентрации фрагментов С0-С2, при которой скорость F-актина уменьшилась в два раза. Это значение составило 288.4±35.9 нМ, 161.8±48.9 нМ и 244.2±13.4 нМ для С0-С2, S304D C0-C2 и S274D/S285D C0-C2, соответственно.

Влияния фосфорилирования C0-C2 фрагмента на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия исследовали, анализируя кальциевую зависимость скорости тонких филаментов по миозину в ИПС. Добавление 0.5 µМ С0-С2 фрагмента на 25% снижало максимальную скорость тонких нитей и увеличивало кальциевую чувствительность скорости с 4.93±0.05 до 5.72±0.02 рСа. Фосфорилированные формы С0-С2 фрагмента на 30% уменьшали максимальную скорость нитей, их кальциевую чувствительность (до 5.34±0.03 с S304D C0-C2 и 5.50±0.04 с S274D/S285D C0-C2) и коэффициент кооперативности Хилла по сравнению с нефосфорилированной формой. Кроме того, фосфорилированные С0-С2 фрагмента увеличивало скорость тонких нитей при низких концентрациях кальция.

Xb-Xb кооперативность является одним их механизмов кальциевой регуляции актин-миозинового взаимодействия. Фосфорилирование C0-C2 фрагмента влияло на Xb-Xb кооперативность. Значение с50 без добавления фрагментов cMyBP-C было равно 60.4±10.5 мкг/мл миозина, добавление С0-С2 фрагментов в концентрациях 0.5 µМ и 1 µМ усиливало мостик-мостиковую кооперативность, уменьшая это значение. При обеих его концентрациях нефосфорилированный фрагмент уменьшал с50 примерно на 30 мкг/мл, а его фосфорилированные формы – на 40 мкг/мл.

Обсуждение

На модели трансгенных мышей показано, что при низких концентрациях кальция фосфорилирование N-терминальной части cMyBP ускоряет циклирование поперечных мостиков, а при его высоких концентрациях замедляет его и пролонгирует время жизни поперечных мостиков за счет увеличения связывания молекул cMyBP-C с актином [Lynch et al. J Mol Cell Cardiol., 2021]. Мы обнаружили, что фосфорилирование cMyBP-C усиливает актин-миозиновое взаимодействие при низких концентрациях кальция и замедляет циклирование мостиков при насыщающей концентрации кальция. Результаты наших экспериментов показывают, что механизм действия фосфорилирования cMyBP-C на актин-миозиновое взаимодействие может быть различен при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция.

Эксперименты выполнены на оборудовании ЦКП ИИФ УрО РАН и поддержаны грантом РНФ № 22-14-00174.

Introduction

The heart contraction occurs due to the interaction of myosin of thick filaments with actin of thin filaments in sarcomere and is regulated by Ca2+. In the absence of calcium, tropomyosin (Tpm) closes myosin binding sites on actin ('blocked' state); when Ca2+ is bound by troponin C, Tpm on actin shifts aside, opening some of these sites ('closed' state); finally the myosin attachment further activates thin filaments ('open' state) [McKillop, Geeves, Biophys J., 1993]. The myosin-binding protein-C (cMyBP-C) takes part in the Ca2+ regulation of cardiac muscle contraction by shifting Tpm from its 'blocked' state to the 'closed' one [Mun et al., PNAS, 2014; Wang et al., Compr Physiol., 2018]. The N-terminal part of the cMyBP-C molecule contains phosphorylation sites Ser275, Ser284, and Ser304. Phosphorylation of cMyBP-C accelerates contraction, increasing the probability of myosin binding to actin and the rate of force development [Sadayappan, de Tombe, Biophys Rev, 2012; Lynch et al. J Mol Cell Cardiol., 2021]. We investigated the effect of the cMyBP-C phosphorylation on the calcium regulation of the actin-myosin interaction in the myocardium using an in vitro motility assay (IVMA).

Methods

Actin was extracted from rabbit skeletal muscles. Myosin was obtained from the left ventricle of the porcine heart. Human cardiac α-Tpm was expressed in E. coli. The human troponin (Tn) complex was provided by I.A. Katrukha (M.V. Lomonosov Moscow State University). Regulated thin filaments were reconstructed from F-actin, Tn and Tpm. N-terminal fragments of human cMyBP-C (C0-C2 fragments) with amino acid substitutions S275D, S284D, and S304D mimicking phosphorylation were expressed in E. coli.

We studied the effect of cMyBP-C phosphorylation on actin-myosin interaction using IVMA, which allows recording the movement of fluorescently labeled F-actin or thin filaments on the myosin surface in a flow cell [Kopylova et al., BBRC, 2017]. The filament velocity was analyzed using GMimPro software [Mashanov&Molloy, Biophys. J., 2007; Matyushenko et al., Biochemistry, 2017]. We fitted the Ca2+ dependence of the filament velocity by the Hill equation. Following parameters were determined: the maximum filament velocity (Vmax) at saturating calcium concentration; calcium sensitivity (pCa50), i.e. pCa at which the velocity is half-maximum, and the Hill cooperativity coefficient. We repeated each experiment three times. Data presented as mean ± SD, comparisons made with the Mann-Whitney U-test (p<0.05).

To study the effect of cMyBP-C fragments on crossbridge-crossbridge (Xb-Xb) cooperativity, we analyzed the dependence of the velocity of thin filaments on myosin concentration and determined its concentration (c50) at which the filament velocity is half-maximum.

Results

To study the effect of cMyBP-C phosphorylation on the actin-myosin interaction, we analyzed the dependence of the velocity of F-actin sliding on myosin in IVMA on the concentration of C0-C2 fragments. The fragment addition dose-dependently reduced the F-actin velocity. We identified the values of the C0-C2 fragment concentration, at which the F-actin velocity decreased twofold. These values were 288.4±35.9 nM, 161.8±48.9 nM, and 244.2±13.4 nM for C0-C2, S304D C0-C2, and S274D/S285D C0-C2, respectively.

We investigated the effects of the C0-C2 fragment phosphorylation on the calcium regulation of actin-myosin interaction by analyzing the calcium dependence of the thin filament velocity over myosin in the IVMA. The addition of 0.5 µM C0-C2 fragment reduced Vmax by 25% and increased its calcium sensitivity from 4.93±0.05 to 5.72±0.02 pCa. The phosphorylated forms of the C0-C2 fragment reduced Vmax of the filaments, its calcium sensitivity (to 5.34±0.03 with S304D C0-C2 and to 5.50±0.04 with S274D/S285D C0-C2) and the Hill cooperativity coefficient by 30% compared to the non-phosphorylated form. In addition, the phosphorylated C0-C2 fragment increased the velocity of thin filaments at low calcium concentrations.

Xb-Xb cooperativity is one of the mechanisms of the calcium regulation of actin-myosin interaction. Phosphorylation of the C0-C2 fragment affected Xb-Xb cooperativity. The c50 value without cMyBP-C fragments was 60.4±10.5 μg/ml of myosin; the addition of C0-C2 fragments at concentrations of 0.5 μM and 1 μM increased the Xb-Xb cooperativity, reducing this value. At both concentrations, the non-phosphorylated fragment decreased c50 by about 30 μg/ml, and the phosphorylated forms by 40 μg/ml.

Discussion

In the transgenic mice model, it was shown that at low calcium concentrations, phosphorylation of the N-terminal part of cMyBP accelerates the cross-bridge cycling; however, at high concentrations, phosphorylation slowed it down and prolonged the cross-bridge lifetime by strengthening the binding of cMyBP-C molecules to actin [Lynch et al. J Mol Cell Cardiol., 2021]. We found that the cMyBP-C phosphorylation enhances the actin-myosin interaction at low calcium concentrations and decelerates cross-bridge cycling at saturated calcium concentrations. The results of our experiments show that the mechanism of action of cMyBP-C phosphorylation on the actin-myosin interaction can differ at saturated and nonsaturated calcium concentrations.

The experiments were performed with the equipment of the Shared Research Center of Scientific Equipment of Institute of Immunology and Physiology and supported by the RSF grant no. 22-14-00174.