Цитохром bd-II - терминальная оксидаза электрон-транспортной цепи Escherichia coli. Фермент восстанавливает молекулярный кислород до воды, используя электроны, полученные от хинола, и сопрягает эту окислительно-восстановительную реакцию с созданием протон-движущей силы. Последняя используется бактериями для производства АТФ и выполнения других видов работы. Цитохром bd-II состоит из субъединиц AppB, AppC и AppX. AppB содержит сайт для связывания хинола и три гема - низкоспиновый b-558 и высокоспиновые b-595 и d [1]. Оксидаза bd-II до сих пор плохо охарактеризована. Ее физиологическая роль не ясна, но, по-видимому, отличается от роли других терминальных оксидаз E. coli, таких как цитохром bd-I и цитохром bo. Примечательно, что в присутствии перекиси водорода (H2O2) цитохром bd-II обеспечивает преимущество в приспособляемости E. coli во время анаэробного роста в воспаленном кишечнике мыши и Salmonella - в обработанном стрептомицином кишечнике [2]. Мы решили установить, играет ли оксидаза bd-II роль в метаболизме H2O2 и толерантности к этому соединению, в дополнение к ее вкладу в сохранение и преобразование энергии мембранами E. coli. С помощью респирометрии высокого разрешения и спектрофотометрии показано, что препараты солюбилизированного детергентом цитохрома bd-II, выделенного из E. coli, способны к быстрому разложению H2O2. Реакция протекает с образованием половины моля О2 на моль H2O2. Скорость реакции растет с увеличением [H2O2] до 0,5 мМ, однако при более высокой [H2O2] стремится к насыщению. Наблюдаемая активность нечувствительна к N-этилмалеимиду, что исключает участие в реакции тиоловых групп белка. Отсутствие ингибирующего действия антимицина А и убихинона-1 свидетельствует о том, что хинолсвязывающий сайт фермента также не участвует в реакции. CO и NO, взаимодействующие с восстановленным гемом d, также не влияют на активность. Кроме того, добавление H2O2 в присутствии дитиотреитола и убихинона-1 не ингибирует О2-редуктазную активность цитохрома bd-II и не приводит к его инактивации. Эти данные свидетельствуют о том, что гем d, на котором происходит четырехэлектронное восстановление О2, едва ли участвует в разложении H2O2. Напротив, реакция ингибируется цианидом (IC50 = 4,5 мкМ) и азидом, которые обычно нацелены на высокоспиновый окисленный гем. Поскольку оксидаза bd-типа имеет два высокоспиновых гема - b-595 и d, но участие последнего в наблюдаемой реакции маловероятно, в качестве сайта в ферменте, ответственного за каталитическое разложение H2O2, мог бы служить гем b-595. Способность оксидазы bd-II эффективно удалять H2O2, возможно, играет роль в физиологии бактерий, наделяя их устойчивостью к окислительному стрессу.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 22-24-00045; https://rscf.ru/project/22-24-00045/).



[1] Friedrich T., Wohlwend D., Borisov V.B. (2022) Int. J. Mol. Sci. 23(6):3166. doi: 10.3390/ijms23063166.

[2] Borisov V.B., Siletsky S.A., Paiardini A., Hoogewijs D., Forte E., Giuffre A., Poole R.K. (2021) Antioxid. Redox Signal. 34(16):1280-1318. doi: 10.1089/ars.2020.8039.

Cytochrome bd-II is a terminal oxidase of the electron transport chain of Escherichia coli. The enzyme reduces molecular oxygen to water using electrons derived from quinol and couples this redox reaction with generation of the proton motive force. The latter is used by bacteria to produce ATP and perform other types of work. Cytochrome bd-II is composed of subunits AppB, AppC and AppX. AppB carries the site for quinol binding and three hemes, the low-spin b-558 and the high-spin b-595 and d [1]. The bd-II oxidase still remains poorly characterized. Its physiological roles are not clear but seem to differ from those of other E. coli terminal oxidases such as cytochrome bd-I and cytochrome bo. Intriguingly, in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), cytochrome bd-II confers a fitness advantage during anaerobic growth to E. coli in the inflamed murine intestine and to Salmonella in the streptomycin-treated gut [2]. We decided to establish whether the bd-II oxidase plays a role in H2O2 metabolism and tolerance, in addition to its contribution to conservation and transformation of energy by the E. coli membranes. By using high-resolution respirometry and spectrophotometry we showed that preparations of the detergent-solubilized cytochrome bd-II isolated from E. coli are capable of rapid degradation of H2O2. The reaction proceeds with generation of half a mole of O2 per mole of H2O2. The reaction rate increases with the increase of [H2O2] up to 0.5 mM, however at higher [H2O2] it tends to saturate. The observed activity is insensitive to N-ethylmaleimide that excludes participation of the protein thiol groups in the reaction. The lack of inhibitory effects of antimycin A and ubiquinone-1 suggests that the quinol binding site of the enzyme is also not involved in the reaction. CO and NO targeting the reduced heme d do not affect the activity as well. Furthermore, the addition of H2O2 in the presence of dithiothreitol and ubiquinone-1 does not inhibit the O2 reductase activity of cytochrome bd-II and does not lead to its inactivation. These data indicate that heme d, at which the four-electron reduction of O2 occurs, hardly takes part in the H2O2 degradation. In contrast, the reaction is inhibited by cyanide (IC50 = 4.5 μM) and azide which usually target a high-spin oxidized heme. Since the bd-type oxidase has two high-spin hemes, b-595 and d, but the latter is unlikely to participate in the observed reaction, heme b-595 could serve as the site in the enzyme responsible for the catalytic decomposition of H2O2. The ability of the bd-II oxidase to efficiently scavenge H2O2 may play a role in bacterial physiology by conferring resistance to oxidative stress.

This work was supported by the Russian Science Foundation (project № 22-24-00045, https://rscf.ru/en/project/22-24-00045/).



[1] Friedrich T., Wohlwend D., Borisov V.B. (2022) Int. J. Mol. Sci. 23(6):3166. doi: 10.3390/ijms23063166.

[2] Borisov V.B., Siletsky S.A., Paiardini A., Hoogewijs D., Forte E., Giuffre A., Poole R.K. (2021) Antioxid. Redox Signal. 34(16):1280-1318. doi: 10.1089/ars.2020.8039.