Казаков М.С.(1), Шитикова Е.Ю.(1), Винокуров А.Ю.(1)

(1) Лаборатория клеточной физиологии и патологии НТЦ биомедицинской фотоники ОГУ имени И.С. Тургенева

Число заболеваний, связанных с мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК) сегодня близится к 400 [1]. Возможность проявления патологии зависит от локализации, уровня гетероплазмии и сочетания мутаций. Мутации в мтДНК могут негативно сказаться на синтезе АТФ из-за нарушений в работе электронтранспортной цепи (ЭТЦ), инициируя появление и развитие ряда заболеваний [2]. В связи с этим целью данной работы является исследование влияния сочетаний мутаций мтДНК на содержание и синтез АТФ.

Материалы и методы

Объектами изучения выступали линии цитоплазматических гибридов (цибридов) (TCP, TCN, TCI, HSM1, HSM2, LSM1, LSM2, MAM1, MAM2, MAM3, 520, 521, 522) на основе клеток ТНР, каждая из которых имеет от 5 до 10 мутаций мтДНК с разным уровнем гетероплазмии, затрагивающих гены первой (m.3336T>C) (в зависимости от линии уровень гетероплазмии меняется от 0% до 37%), второй (m.5178C>A) (от 0% до 22%), пятой (m.13513G>A) (от 10% до 68%), шестой (m.14459G>A) (от 0% до 61%) субъединиц I комплекса, цитохрома b (m.15059G>A) (от 0% до 38%), (m.14846G>A) (от 0% до 55%), 12S рРНК (del652G) (от 0% до 44%), (m.1555A>G) (от 0% до 28%) и тРНКЛей (m.c3256C>T) (от 0% до 50%), (m.12315G>A) (от 0% до 44%). Для анализа физиологического уровня АТФ применяли люциферазный метод с применением набора определения АТФ (LifeTechnologies, США). Контроль уровня люминесценции вели на планшетном флуориметре FLUOstar Omega. Измерение времени истощения запасов клеточного АТФ проводили методом флуоресцентной микроскопии при помощи зонда magFura-2 на длинах волн возбуждения 340 нм (Mg-связанная форма) и 380 нм (свободная форма). Перед исследованием клетки инкубировали в 3 мкМ растворе зонда. Синтез АТФ блокировали добавлением олигомицина А (2 мкг/мл) и йодуксусной кислоты (100 мкМ). Момент резкого увеличения отношения флуоресценции 340 нм/ 380 нм являлся сигналом истощения запаса АТФ. Для оценки сопряженности окислительного фосфорилирования провели исследование дыхания полярографическим методом с помощью респирометра Oxytherm+R. В качестве среды измерения использовали HBSS с содержанием глюкозы 10 мМ. В ходе изучения выполняли анализ базовой скорости потребления кислорода и после внесения ингибитора АТФ-синтазы олигомицина А (2 мкг/мл).

Результаты и их обсуждение.

Почти во всех линиях цибридов отмечено статистически достоверное снижение содержания АТФ относительно линии ТНР (от 1,9-кратного для TCN до 19-кратного для LSM1). Такое изменение может быть следствием как нарушений синтеза АТФ, так и повышенного потребления макроэрга.

Для подтверждения теории о повышенном потребления АТФ были проведены исследования с использованием ратиометрического флуоресцентного зонда magFura-2. Результаты измерений показали, что большая часть исследуемых линий имеет не меньшее время истощения запасов АТФ, чем THP (от 3,8 ч. у 522 до 7,3 ч. у LSM2 и 4,9 ч. у ТНР). Данный параметр не коррелирует с данными по содержанию АТФ. Одной из причин может быть высокий уровень разобщения в клетках, для оценки которого было проведено исследование скорости дыхания клеток. Все линии цибридов имеют сниженную скорость дыхания в сравнении с ТНР (от 33 нг(О2)/(мин*10^6 клеток) у LSM1 до 54 нг(О2)/(мин*10^6 клеток) у MAM2 и 64 нг(О2)/(мин*10^6 клеток) у ТНР). Статистически значимый ответ на олигомицин А наблюдался для линий THP, MAM1 и MAM2 (23%, 15% и 18% соответственно). Таким образом, скорость потребления кислорода, сопряженного с синтезом АТФ, в случае всех клеточных линий относительно невелика (среднее изменение около 14%) из-за возможного разобщения, которое может быть инструментом снижения негативных последствий митохондриальной дисфункции, связанных с мутациями генов рРНК (del652G), тРНК (m.3256C>T, m.12315G>A) и комплексов ЭТЦ (m.15059G>A, m.14846G>A, m.5178C>A) в мтДНК [3]. В тоже время данные линий MAM1 и MAM2 показывают более высокий уровень митохондриальной функции, несмотря на значительную мутационную нагрузку. По нашему мнению, это может быть связано с высоким уровнем гетероплазмии мутаций 5 субъединицы I комплекса (m.13513G>A) и 12S рРНК (m.1555A>G), для которых в ряде работ показана отрицательная корреляция с развитием атеросклероза [4, 5]. Вероятно, это связано с тем, что мутация m.1555A>G препятствует синтезу дефектных белков ЭТЦ из-за нарушения работы рибосом, а мутация m.13513G>A приводит к увеличению функциональности комплекса I.

Таким образом, нарушение метаболизма АТФ, и дальнейшее развитие патологии является результатом не только уровня гетероплазмии отдельных мутаций, но также их взаимным влиянием, которое может иметь как негативный, так и компенсационный характер.

Литература

1. Naviaux R.K. Developing a systematic approach to the diagnosis and classification of mitochondrial disease // Mitochondrion. - 2004. - V. 4. - P. 351-61.

2. McInnes J. Mitochondrial-associated metabolic disorders: foundations, pathologies and recent progress // Nutr Metab (Lond). - 2013. - V. 10(1). - 63.

3. Sazonova M.A., Sinyov V.V., Ryzhkova A.I., Galitsyna E.V., Khasanova Z.B., Postnov A.Y., Yarygina E.I., Orekhov A.N., Sobenin I.A. Role of Mitochondrial Genome Mutations in Pathogenesis of Carotid Atherosclerosis // Oxid Med Cell Longev. - 2017. - 6934394.

4. Sazonova M.A., Sinyov V.V., Barinova V.A., Ryzhkova A.I., Zhelankin A.V., Postnov A.Y., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Mosaicism of mitochondrial genetic variation in atherosclerotic lesions of the human aorta // Biomed Res Int. - 2015. - 825468.

5. Sazonova M.A., Chicheva M.M., Zhelankin A.V., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N.. Association of mutations in the mitochondrial genome with the subclinical carotid atherosclerosis in women // Experimental and Molecular Pathology. – 2015. – V. 99. – P. 25-32.



Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-15-00317.

Kazakov M.S.(1), Shitikova E.Yu.(1), Vinokurov A.Yu.(1)

(1) Laboratory of Cell Physiology and Pathology of the STC Biomedical Photonics Orel State University named after I.S.Turgenev,

The number of diseases associated with mitochondrial DNA (mtDNA) mutations is approaching 400 [1]. The possibility of pathology manifestation depends on the localization, the level of heteroplasmy, and the combination of mutations. Mutations in mtDNA can negatively affect ATP synthesis due to disturbances in the electron transport chain (ETC), initiating the appearance and development of a number of diseases [2]. Therefore, the aim of this work is to investigate the effect of mtDNA mutation combinations on ATP content and synthesis.

Materials and methods

The lines of cytoplasmic hybrids (cybrids) (TCP, TCN, TCI, HSM1, HSM2, LSM1, LSM2, MAM1, MAM2, MAM3, 520, 521, 522) based on THP cells, each having from 5 to 10 mtDNA mutations with different heteroplasmy levels, affecting genes one (m.3336 T>C) (depending on the lineage, the level of heteroplasmy varies from 0% to 37%), the second (m.5178C>A) (0% to 22%), the fifth (m.13513G>A) (10% to 68%), the sixth (m.14459 G>A) (0% to 61%) subunits of complex I, cytochrome b (m.15059G>A) (0% to 38%), (m.14846 G>A) (0% to 55%), 12S rRNA (del652G) (0% to 44%), (m.1555A>G) (0% to 28%), and tRNA(Leu) (m.c3256C>T) (0% to 50%), (m.12315G>A) (0% to 44%). To analyze the physiological level of ATP, we used a luciferase method using an ATP determination kit (LifeTechnologies, USA). Luminescence levels were monitored using a FLUOstar Omega fluorimeter. Depletion time of cellular ATP was measured by fluorescence microscopy using magFura-2 probe at excitation wavelengths of 340 nm (Mg-bound form) and 380 nm (free form). Before the study, cells were incubated in 3 μM probe solution. ATP synthesis was blocked by adding oligomycin A (2 μg/ml) and iodoacetic acid (100 μM). The moment of a sharp increase in the fluorescence ratio of 340 nm/ 380 nm was a signal of ATP depletion. To assess the conjugation of oxidative phosphorylation, we performed a polarographic respiration study using an Oxytherm+R respirometer. HBSS with 10 mM glucose content was used as measuring medium. During the study, baseline oxygen consumption rate was analyzed and after adding the ATP synthase inhibitor oligomycin A (2 μg/ml).

Results and discussion.

A statistically significant decrease in ATP content relative to the THP line (from 1.9-fold for TCN to 19-fold for LSM1) was observed in almost all cybrid lines. This change may be a consequence of both impaired ATP synthesis and increased macroerg consumption.

To confirm the theory of increased ATP consumption, studies were performed using the ratiometric fluorescence probe magFura-2. The results showed that most of the lines studied had no less ATP depletion time than THP (from 3.8 h. in 522 to 7.3 h. in LSM2 and 4.9 h. in THP). This parameter does not correlate with the data on ATP content. One reason may be the high level of cell dissociation, which was assessed by a cell respiration rate study. All cybrid lines had reduced respiration rates compared with THP (from 33 ng(O2)/(min*10^6 cells) in LSM1 to 54 ng(O2)/(min*10^6 cells) in MAM2 and 64 ng(O2)/(min*10^6 cells) in THP). A statistically significant response to oligomycin A was observed for THP, MAM1, and MAM2 lines (23%, 15%, and 18%, respectively). Thus, the rate of oxygen consumption associated with ATP synthesis is relatively low in the case of all cell lines (mean change of about 14%) because of possible uncoupling, which may be a tool to reduce the negative effects of mitochondrial dysfunction associated with mutations of the rRNA (del652G), tRNA (m.3256 C>T, m.12315G>A) and ETC complexes (m.15059G>A, m.14846G>A, m.5178C>A) in mtDNA [3]. At the same time, data from the MAM1 and MAM2 lines show a higher level of mitochondrial function despite a significant mutational load. In our opinion, this may be due to a high level of heteroplasmy mutations of complex 5 subunit I (m.13513G>A) and 12S rRNA (m.1555A>G), for which a number of studies have shown a negative correlation with the development of atherosclerosis [4, 5]. This is probably due to the fact that the m.1555A>G mutation prevents the synthesis of defective ETC proteins due to ribosome disruption, while the m.13513G>A mutation leads to an increase in Complex I functionality.

Thus, disruption of ATP metabolism and further development of the pathology is the result not only of the heteroplasmy of individual mutations, but also of their mutual influence, which can have both negative and compensatory character.

Literature

1)Naviaux R.K. Developing a systematic approach to the diagnosis and classification of mitochondrial disease // Mitochondrion. - 2004. - V. 4. - P. 351-61.

2)McInnes J. Mitochondrial-associated metabolic disorders: foundations, pathologies and recent progress // Nutr Metab (Lond). - 2013. - V. 10(1). - 63.

3)Sazonova M.A., Sinyov V.V., Ryzhkova A.I., Galitsyna E.V., Khasanova Z.B., Postnov A.Y., Yarygina E.I., Orekhov A.N., Sobenin I.A. Role of Mitochondrial Genome Mutations in Pathogenesis of Carotid Atherosclerosis // Oxid Med Cell Longev. - 2017. - 6934394.

4)Sazonova M.A., Sinyov V.V., Barinova V.A., Ryzhkova A.I., Zhelankin A.V., Postnov A.Y., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Mosaicism of mitochondrial genetic variation in atherosclerotic lesions of the human aorta // Biomed Res Int. - 2015. - 825468.

5)Sazonova M.A., Chicheva M.M., Zhelankin A.V., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N.. Association of mutations in the mitochondrial genome with the subclinical carotid atherosclerosis in women // Experimental and Molecular Pathology. – 2015. – V. 99. – P. 25-32.



This work was supported by Grant No. 22-15-00317 of the Russian Science Foundation.